孫旺旺 孟憲敏 徐秀源 伍敏華 秦夢陽 林夢夢 張新妍 岳國忠*

(1.河北科技師范學院園藝科技學院，秦皇島 066004； 2.北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心，北京市農(nóng)林科學院，北京 100097； 3.國家蔬菜工程技術研究中心，北京市農(nóng)林科學院，北京 100097； 4.唐山植物園，唐山市園林綠化管理局，唐山 063000)

金葉連翹(Forsythiakoreana‘Sun Gold’)隸屬于木犀科(Oleaceae)連翹屬(ForsythiaVahl)，又名黃金條、金葉朝鮮連翹，是朝鮮連翹(F.koreana)由葉色變異經(jīng)多次選育嫁接而培育出來的黃葉變種[1]。金葉連翹冠層上位成熟葉片常年呈黃色，其生態(tài)適應性強，具有抗旱、抗寒的特點，能耐受-30℃以下低溫，為園林色塊布置的優(yōu)良彩葉植物[2]。

通常，高等植物的葉片中主要含有葉綠素、類胡蘿卜素和花色素苷等光合色素，葉綠素含量通常大于類胡蘿卜素含量，從而使得植物葉片呈現(xiàn)綠色[3]。但因葉綠素較易被破壞或降解，導致葉綠素含量的不同往往直接表現(xiàn)為葉色的不同，此類突變體通常被稱為葉綠素突變體[4]，彩葉植物多屬于此類型。前人研究表明，黃化葉片的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量均大幅減少，而總葉綠素含量減少是導致葉片黃化的主要原因[4～5]；而王歡利等[5]認為金葉植物主要表現(xiàn)為總葉綠素含量及總葉綠素/類胡蘿卜素比值的降低，而與葉片花青素含量無關。葉綠素含量降低通常導致葉綠體發(fā)育缺陷，異常的葉綠體結構會改變各種色素的含量及比例，從而導致葉色變異[6]。對于黃化葉片的色素含量及葉綠體超微結構的研究，至今已在小麥[7～8]、水稻[9]、芝麻[10]、甘藍[11]、烏桕[12]、花葉線藝蘭[13]和‘金薇’[14]等植物中開展。一般認為，黃化突變體的葉綠體結構較為簡單，基粒和基粒片層數(shù)目少，或未分化出基粒和基粒片層；而有些黃化突變體，不僅葉綠體發(fā)育存在明顯缺陷，且葉綠體數(shù)目較少[5]。葉綠體的發(fā)育按照時序可以分為3個階段：前葉綠體時期、單片層形成期和基粒形成期[15]，因此，葉綠體發(fā)育停滯于不同時期也會影響葉片顏色[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，由于表皮細胞與柵欄組織細胞間或柵欄組織內的大量間隙(氣室)會使得入射光大量反射，造成葉片呈現(xiàn)白色[17]；葉片表皮絨毛、表皮蠟質的存在以及其他結構變化會使植物葉片呈現(xiàn)白色或藍暈色[18～19]。由于葉綠體主要存在于柵欄組織細胞內，袁明等[20]研究表明柵欄組織細胞和海綿組織細胞的葉綠體大小和數(shù)量存在明顯差異，所以本試驗主要針對柵欄組織部位葉綠體進行研究。

近年來，金葉連翹在北方園林綠化中應用越來越受到重視，研究其呈色機理對合理地開發(fā)金葉連翹資源，更好地發(fā)揮其生態(tài)意義和景觀價值具有十分重要的意義。但是，關于金葉連翹呈色機理尚未見報道。目前，對彩葉植物呈色機理的研究多集中于葉片色素含量、葉綠體超微結構等方面，但少見觀察葉片橫切面顯微結構的研究。本試驗以朝鮮連翹成熟葉片(深綠色)為對照，以金葉連翹冠層上、中和下位成熟葉片為研究對象，從葉片色素含量、葉綠體超微結構和葉片橫切面顯微結構3個方面進行探討，以期為金葉連翹葉片呈色機理研究提供指導和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用種植于河北科技師范學院昌黎校區(qū)試驗站的生長狀況良好、長勢基本一致的3年生朝鮮連翹(CK)和金葉連翹為試材，實驗取樣均在2017年6月進行。

1.2 葉片形態(tài)特征

于2017年6月25日上午9:00～11:00選取2年生枝條上的當年生的長勢和葉齡基本一致的成熟葉片。以朝鮮連翹成熟葉片為對照，比較金葉連翹冠層上、中和下位的3種成熟葉片的顏色和大小。每冠層和對照各取15片葉進行比較，共3次重復。

1.3 葉片色素含量測定

參照張憲政[21]的試驗方法。將葉片洗凈擦干，去掉主葉脈和葉柄，剪碎，稱取0.1 g葉片放入盛有10 mL 80%丙酮∶95%乙醇=1∶1混合提取液的試管中，密封，遮光，4℃浸提24 h左右，至葉片變白，過濾。以提取液為參比液，用島津-765s分光光度計在663、645及440 nm波長處測定光密度值(OD值)，再根據(jù)公式計算總葉綠素(Chla+b)、葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的含量。所有測定均設3次獨立取樣試驗。

1.4 葉片解剖結構1.4.1 葉綠體超微結構觀察

參照付洪蘭[22]的方法。將葉片主脈中段切取4 mm×1 mm的長條；投入4%戊二醛固定液中，抽真空，固定24 h以上；用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.2)漂洗，再用1%鋨酸固定2 h；乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋；采用Leica EMUC 6超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾硝酸鉛染色；在日立H-7650透射電子顯微鏡下觀察柵欄組織并拍照。

1.4.2 葉片橫切面結構觀察

參照李和平[23]的方法。取葉片中下部主脈一側約5 mm×5 mm的小片，投入FAA固定液中，抽真空，固定24 h以上，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚度1.2～1.5 μm)，番紅—固綠染色，加拿大中性樹膠封片制備成樣品切片。每個樣品選取10張切片，每張切片隨機選3個視野，在Zeiss Axiao Lab. Al顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察，拍照。測量葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度及海綿組織厚度并計算柵欄組織/海綿組織(柵/海比)。所有測定均設3次獨立取樣試驗。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 20.0軟件中的Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同葉色類型成熟葉片形態(tài)特征

一般情況下，在生長季內，朝鮮連翹(CK)成熟葉片只表現(xiàn)為深綠色(圖1A)，而生長成熟期的金葉連翹不同冠層部位成熟葉片顏色和葉面積存在明顯差異，冠層上、中、下位成熟葉片分別呈現(xiàn)為黃色、黃綠色和淺綠色，其黃葉和黃綠葉的葉面積分別為12.81和13.44 cm2，極顯著小于自身淺綠葉和對照(P<0.01)(見表1，圖1)。

表1 不同葉色類型葉片顏色和葉面積

Table 1 Leaf color and area of different leaf color types

冠層Tree canopy葉色Leaf color葉面積Blade area(cm2)對照CK深綠色Deep green23.24±2.55Aa上Top黃色Yellow12.81±1.92Bb中Middle黃綠葉Yellow green13.44±1.82Bb下Bottom淺綠色Light green22.82±1.92Aa

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準誤差表示；同列不同小寫字母表示5%水平上顯著，同列不同大寫字母表示1%水平上顯著；下同。

Note:The data form are mean values±standard error;Different lowercase letters in the same column indicate significant at 5% level,and different capitals in the same column indicate significant at 1% level.The same is as below.

圖1 不同葉色類型葉片形態(tài)特征 A.朝鮮連翹深綠葉(CK)；B～D.金葉連翹冠層上、中、下位葉Fig.1 Morphological characteristics of leaves with different leaf color types A.Deep green leaves(CK) of F.koreana; B-D.Leaves of the top,middle and bottom canopy of F.koreana ‘Sun Gold’,respectively

表2 不同葉色類型葉片色素含量

2.2 不同葉色類型成熟葉片相關色素含量比較

由表2可知，金葉連翹3種成熟葉片的總葉綠素含量均低于對照，達到極顯著水平(P<0.01)，黃、黃綠、淺綠葉分別是對照的0.51%、4.44%和66.47%。而金葉連翹黃、黃綠葉的總葉綠素含量差異不顯著(P>0.05)，但均極顯著低于淺綠葉(P<0.01)，分別是淺綠葉的0.76%和6.69%。黃、黃綠葉的類胡蘿卜素含量均高于其總葉綠素含量，總葉綠素/類胡蘿卜素比值均極顯著低于對照和淺綠葉(P<0.01)，分別為0.55和0.56，一般情況下總葉綠素含量/類胡蘿卜素約為3[17～20]。此外，黃綠葉的葉綠素a/b顯著高于黃葉、淺綠葉和對照(P<0.05)?？側~綠素含量降低、總葉綠素/類胡蘿卜素比值降低與金葉連翹葉片呈黃、黃綠和淺綠色有關。

2.3 不同葉色類型成熟葉片葉綠體超微結構比較

對照的柵欄組織細胞內葉綠體緊密排列于細胞壁上，明顯呈紡綞形或梭形，部分葉綠體呈多邊形或錐形；葉綠體被膜清晰且完整，類囊體基粒分布較為均勻，基粒片層垛疊層數(shù)較多，排列致密有序；淀粉粒體積較大，嗜鋨顆粒分散且數(shù)量少、體積大(見圖2:A1～A3)。相比對照，金葉連翹3種不同葉片的葉綠體結構均存在明顯差異。黃葉柵欄組織細胞內的葉綠體數(shù)量極少，體積小，呈球形或不規(guī)則形狀，內部有單片層類囊體(原片層體)(見圖2:B1～B3)；無淀粉粒，積累了較小的嗜鋨顆粒，且部分葉綠體降解嚴重，膜被嚴重破損(見圖2～B2)；此外，細胞質中有同心圓狀排列的多層膜結構(見圖2:B3)。黃綠葉柵欄組織細胞內葉綠體數(shù)量較少，體積較小，呈紡錘形或球形，類囊體分化出片層，無淀粉粒，嗜鋨顆粒數(shù)量多，葉綠體被膜模糊且部分破裂(見圖2:C1～C3)；部分葉綠體內有空腔和透明的囊泡(見圖2:C2)；有些葉綠體內含有半透明的不規(guī)則球形結構(見圖2:C3)，可能是用于類囊體系統(tǒng)構建的膜結合顆粒包涵物[24]。淺綠葉柵欄組織細胞內葉綠體數(shù)量較多，呈紡錘形或梭形，中間稍微向細胞中間膨大；葉綠體被膜模糊，淀粉粒體積巨大且數(shù)量多，受淀粉粒的擠壓，類囊體片層扭曲；基粒片層垛疊較多，但片層腫脹，嗜鋨顆粒數(shù)量較少、體積較大(見圖2:D1～D3)。

2.4 不同葉色類型成熟葉片橫切面顯微結構比較

對照和金葉連翹3種葉片橫切面顯微結構相同，均由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮組成；與對照相比，金葉連翹3種葉片橫切面結構中并沒有出現(xiàn)大量間隙(氣室)(見圖3)。對照顯微結構切片著色較深，柵欄組織細胞細長，排列較緊密(見圖3A)。但是，金葉連翹黃色葉片顯微結構切片著色較淺，柵欄組織細胞形態(tài)難以辨別，可能是黃葉柵欄組織細胞內細胞器解體所致(見圖3B)；此外，黃綠葉上表皮細胞有凸起的現(xiàn)象(見圖3D)。

由表3可知，金葉連翹3種不同葉片的柵欄組織、海綿組織、上表皮、下表皮厚度及柵/海比差異不顯著，但均與對照存在顯著差異。其中，黃葉、黃綠葉和淺綠葉的葉片厚度分別較對照降低34.70%、52.17%和44.62%；黃葉、黃綠葉和淺綠葉的柵欄組織厚度分別較對照降低59.47%、33.44%和32.37%；黃葉、黃綠葉和淺綠葉的柵/海比分別較對照降低50.48%、56.83%和37.46%。金葉連翹3種不同葉片僅有黃葉與黃綠葉的葉片厚度存在極顯著差異，一般認為強光照能使葉片增厚[20]。由分析可知，金葉連翹3種不同成熟葉片的顏色與其橫切面解剖結構特征無關。

圖2 不同葉色類型葉片葉綠體超微結構 A.朝鮮連翹深綠葉(CK)；B～D.金葉連翹黃色葉、黃綠葉、淺綠葉 CW.細胞壁；CH.葉綠體；ME.葉綠體被膜；G.基粒；S.淀粉粒；O.嗜鋨顆粒；V.囊泡；PLB.原片層體；CC.同心圓結構Fig.2 Chloroplast ultrastructure of leaves with different leaf color types A. Deep green leaves of F.koreana(CK); B-D. Leaves of the yellow,yellow green and light green leaves of F.koreana ‘Sun Gold’,respectively CW. Cell walls; CH. Chloroplasts; ME. Membrane envelop of chloroplast; G. Granulation; S. Starch granules; O. Osmium particles; V. Vesicle; PLB. Prolamellar body; CC. Concentric circles

圖3 不同葉色類型葉片解剖結構比較 A.朝鮮連翹的深綠葉(CK)；B～D.金葉連翹黃色葉、黃綠葉、淺綠葉 UP.上表皮；PT.柵欄組織；ST.海綿組織；AC.氣腔；S.氣孔Fig.3 Anatomical structure comparison of leaves with different leaf color types A.Deep green leaves(CK) of F.koreana; B-D.Leaves of the yellow,yellow green and light green leaves of F.koreana ‘Sun Gold’,respectively UP.Upper epidermis; PT.Palisade tissue; ST.Spongy tissue; AC.Air cavity; S.Stoma

表3 不同葉色類型葉片橫切面厚度

3 討論

Falbel等[25]根據(jù)葉綠素b含量減少將葉綠素突變體比值劃為兩類：一類為完全不含葉綠素b的突變體，如擬南芥突變體[26]、大麥突變體chlorina f2[27]；另一類為總葉綠素及葉綠素b合成減少突變體，目前報道的突變體以后者居多。本研究表明，金葉連翹的黃葉、黃綠葉的總葉綠素含量分別是對照的0.51%和4.44%，是自身淺綠葉的0.76%和6.69%，且黃綠葉的葉綠素b含量降低幅度大于葉綠素a，表明金葉連翹屬后者。肖華貴等[4]研究表明，油菜黃化突變體的總葉綠素/類胡蘿卜素比值降低，約為對照的0.5倍；張振宇等[14]發(fā)現(xiàn)‘金薇’總葉綠素下降幅度大于類胡蘿卜素，總葉綠素/類胡蘿卜素比值降低至1.26～2.08，是導致‘金薇’形成黃葉的直接原因。本研究發(fā)現(xiàn)，黃、黃綠葉片總葉綠素/類胡蘿卜素比值分別為0.547和0.556，極顯著低于淺綠葉和對照(P<0.01)。類胡蘿卜素的相對含量提高，能以葉黃素循環(huán)方式來消耗過剩的光能，使葉綠素免受光氧化作用的損壞[28]。金葉連翹屬陰性植物，推測是在全光照條件下為避免葉綠素被損壞，其類胡蘿卜素相對含量提高，進一步證實葉綠素/類胡蘿卜素比值降低導致金葉連翹冠層上、中位葉片呈黃、黃綠色。

葉綠素含量降低往往伴隨著葉綠體結構的異常，異常的葉綠體結構進而會影響葉片的顏色[6]。本研究表明，金葉連翹3種葉片總綠素含量降低的同時葉綠體發(fā)育均出現(xiàn)異常。黃葉和黃綠葉的葉綠體發(fā)育不完善，內部結構簡單，無明顯膜被結構，基粒和基粒片層數(shù)較少，與油菜[4]、小麥[7]、水稻[9]、芝麻[10]黃化突變體的研究結果相似。范燕萍等[13]認為嗜鋨滴是因葉綠體中脂質合成與膜系統(tǒng)形成之間的代謝作用的不平衡而產(chǎn)生的，隨著膜系統(tǒng)的崩解，構成膜的脂質成分與存在于基粒中的類胡蘿卜素得以積累。本研究表明，黃葉、黃綠葉的葉綠體內有較多嗜鋨顆粒，說明處于單片層時期的葉綠體正在降解，另外，黃葉細胞質中有特殊同心圓結構，可能是發(fā)育為葉綠體的前質體[29]。因此，葉綠體發(fā)育停滯和降解可能是金葉連翹出現(xiàn)黃葉、黃綠葉的原因之一。與黃葉相比，黃綠葉的葉綠體發(fā)育相對完善，葉綠體類囊體開始分化；與對照相比，黃綠葉的葉綠體數(shù)量偏少，葉綠體類囊體內膜總量少且發(fā)育程度低，內膜凹陷，開始形成獨立的類囊體片層，有少量透明的‘囊泡’。這與初志戰(zhàn)等[16]在水稻黃綠葉中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相似，但是本研究發(fā)現(xiàn)金葉連翹黃綠葉葉綠體內部有空腔。與對照相比，淺綠葉的葉綠體結構都比較完整，但是淺綠葉葉綠體類囊體基粒片層垛疊較多，片層腫脹且扭曲，這是由于冠層底部的淺綠葉，光照強度較低，光合速率較低，淀粉粒積累，壓類囊體受巨大淀粉粒的擠壓所致[30]；另外與對照相比葉總綠素含量呈極顯著降低。因此，類囊體膜結構異常和總葉綠素降低與金葉連翹葉片呈現(xiàn)淺綠色有關。

根據(jù)彩葉的形成原因不同，可將彩葉劃分為色素型和結構型[31]。其中結構型分為：①氣室型，如王振興等[17]發(fā)現(xiàn)狗棗獼猴桃葉片呈白色主要是由于柵欄組織層含有大量氣室，入射光大量反射，造成葉片呈現(xiàn)白色；②表皮型，如Thomas等[19]發(fā)現(xiàn)藤卷柏葉片表皮細胞上有蠟質結構附著，葉片呈藍色。袁明等[17]認為金葉女貞適應不同冠層部位的小環(huán)境變化，通過調整氣孔特性、柵欄組織和海綿組織的厚度和細胞大小、葉綠體的結構和數(shù)量以及光合色素的含量等與光合作用相關的結構，分化出黃化葉。而本研究表明，金葉連翹上下表皮均沒有發(fā)現(xiàn)明顯的腺毛和蠟質，說明沒有特殊附著物使金葉連翹葉色變黃；金葉連翹葉片柵欄組織排列緊密，沒有特殊的氣室結構，表皮細胞上沒有蠟質結構附著，柵欄組織和海綿組織的厚度沒有顯著差異。因此，金葉連翹葉片沒有特殊顯微結構影響其葉色。

本研究表明，不同冠層的金葉連翹葉片呈現(xiàn)不同的顏色與總葉綠素含量、總葉綠素/類胡蘿卜素比值、葉綠體結構及葉綠體發(fā)育程度有關。植物葉色是復雜生理生化代謝的體現(xiàn)，受到諸多方面因素的影響，如光照、溫度和水分等，因此金葉連翹葉片呈色的機制有待進一步深入研究和完善。本研究還發(fā)現(xiàn)，黃綠葉葉綠素a/b比值顯著高于其他葉片，且存在上表皮細胞凸起現(xiàn)象。按葉片顏色漸變規(guī)律來看，黃葉或淺綠葉應該是這種現(xiàn)象，可結果并非如此，這一現(xiàn)象有待進一步研究。