劉 悅 趙 凱 呂冠斌 姜廷波 周博如

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

AP2/ERF基因家族是植物所特有的、最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，該家族轉(zhuǎn)錄因子參與植物的多種生物學過程，包括植物的生長、花發(fā)育、果實發(fā)育、種子發(fā)育、損傷、病菌防御、高鹽、干旱等環(huán)境脅迫響應等[1～4]。根據(jù)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和特點，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為AP2亞家族、EREBP亞家族以及RAV亞家族[5]。ERF類轉(zhuǎn)錄因子的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域N-端是由高度保守的19～20個堿性YRG基元組成的YRG區(qū)，C-端是由含有42～43個氨基酸殘基組成的RAYD區(qū)。AP2/ERF基因家族可以通過結(jié)合脫水應答元件DRE和CRT應答干旱、低溫、高鹽脅迫[6]，通過與GCC-box及誘導元件結(jié)合應答脅迫[7]。近年來，越來越多的研究表明AP2/ERF家族基因參與到了植物的生物、非生物脅迫[8～11]。研究表明毛果楊PtrDREB28基因能夠增強植物對低溫和高溫的耐受能力[12]。轉(zhuǎn)錄因子ERF76基因能夠提高小黑楊的耐鹽能力[13]。ERF11轉(zhuǎn)錄因子屬于EREBP亞家族成員之一，研究表明ERF11基因通過激活赤霉素生物合成、刺激信號傳導促進節(jié)間生長[14]；在擬南芥(Arabidopsis)中，乙烯反應因子ERF6和ERF11對甘露醇誘導的擬南芥生長抑制有抗拮作用[15]；在白樺(Betulaplatyphylla)中，ERF11基因響應高鹽干旱脅迫[16]；ERF11基因激活BT4轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)丁香假單胞菌免疫[17]，但ERF11基因功能未在楊樹中有相關報道。為探明小黑楊ERF11基因應答高鹽及干旱兩種脅迫的表達特點，本研究用RT-PCR從小黑楊(Populussimonii×P.nigra)葉片中克隆了ERF11基因cDNA片段，對ERF11基因進行生物信息學分析，用RT-qPCR分析了ERF11基因在NaCl、甘露醇模擬干旱脅迫條件下的表達特性，為探明ERF11基因在楊樹抗逆中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

植物材料為培養(yǎng)1個月的同一無性系雙單倍體小黑楊組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的克隆

利用天恩澤柱式植物RNAout試劑盒提取總RNA，用PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設計引物(見表1)，對其克隆，按照擴增反應程序：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳回收，與pMD19-T載體連接，42℃熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆送至生工測序，保留測序正確的菌液進行后續(xù)實驗。

1.2.2 生物信息學分析

ExPasy(http://web.expasy.org/protparam/)在線Protparam軟件分析ERF11氨基酸的理化性質(zhì)。ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)的Kyte and Doolittle算法分析ERF11蛋白的親水/疏水性。Singa-P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的神經(jīng)網(wǎng)絡算法對ERF11

表1 實驗引物設計

蛋白進行分析并預測其信號肽。TMPred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html#opennewwindow)預測ERF11蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。SOMPA(npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma)分析ERF11蛋白的二級結(jié)構(gòu)。Swissmode(https://swissmodel.expasy.org/interactive)分析ERF11蛋白的三級結(jié)構(gòu)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)對ERF11基因序列蛋白進行同源序列比對，并利用MEGA(Version 5.2)構(gòu)建進化樹。用在線預測軟件Yloc(http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi)進行亞細胞定位預測分析[13]。

1.2.3PBI121-ERF11-GFP植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)載體PBI121-GUS與目的基因ERF11序列設計含SpeⅠ和XbaⅠ酶切位點的酶切引物(見表1)，對其克隆，擴增反應程序與目的基因克隆相同。于37℃雙酶切反應4 h后瓊脂糖凝膠回收，利用T4DNA連接酶將純化后的PBI121酶切產(chǎn)物和ERF11酶切產(chǎn)物進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，利用載體引物和ERF11基因特異性引物進行菌液PCR檢測，并將陽性克隆菌液送去測序。

1.2.4 基因槍法瞬時轉(zhuǎn)化

利用基因槍法瞬時轉(zhuǎn)化ERF11-GFP融合蛋白，具體操作根據(jù)PDS-1000臺式基因槍使用說明。暗培養(yǎng)36～72 h后，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.5 脅迫下處理表達分析

將小黑楊組培苗置于相對濕度60%～70%、14 h光/10 h暗、平均溫度25℃條件下土培1個月后，將材料分為42組，每3組進行同一處理。分別用水(對照組)、0.15 mol·L-1NaCl和200 mmol·L-1甘露醇處理0、3、6、9、12和24 h后，分別將樣本的根、莖、葉保存至-80℃。

利用柱式植物RNA提取試劑盒提取植物總RNA，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA用無菌的ddH2O稀釋100倍，作為實時熒光定量PCR的模板，熒光定量試劑盒為SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。BLAST分析預測該基因保守結(jié)構(gòu)域，并設計實時熒光定量PCR引物(見表1)。PCR在ABI7500熒光PCR儀上進行。以內(nèi)參基因ACT為對照，用2-ΔΔCT計算法計算其相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 ERF11基因克隆及氨基酸理化性質(zhì)分析

從小黑楊模板cDNA中克隆獲得ERF11基因，該基因全長732 bp，編碼243個氨基酸，含20種氨基酸(見圖1)，具完整的開放閱讀框。ERF11蛋白的化學式為C1132H1757N347O361S9，等電點(PI)為9.01，不穩(wěn)定系數(shù)為50.12，屬于不穩(wěn)定蛋白。ERF11蛋白總平均疏水指數(shù)為-0.876，親水性區(qū)域分布均勻，氨基酸數(shù)量較多，為親水蛋白(見圖2)。利用在線軟件SOPMA對楊樹ERF11蛋白的氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果表明該蛋白主要由無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α-螺旋、β-折疊組成(見表2)。

表2 ERF11蛋白的二級結(jié)構(gòu)

2.2 信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域預測

信號肽是N端的引導新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的一段氨基酸序列，通常由20～30個氨基酸殘基組成。信號肽預測結(jié)果表明，ERF11不存在信號肽(見圖3)?？缒そY(jié)構(gòu)是一段一般由20個左右的疏水性氨基酸組成的片段，主要形成ɑ-螺旋。根據(jù)在線工具TMPred預測ERF11的跨膜結(jié)構(gòu)，該基因蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)(見圖4)。

圖1 ERF11蛋白編碼氨基酸含量Fig.1 Secondary structure of ERF11 protein

圖2 ERF11蛋白氨基酸親疏水性區(qū)域分布圖Fig.2 Distribution map of amino acids of ERF11 protein

圖3 小黑楊ERF11蛋白信號肽預測Fig.3 Prediction of ERF11 protein signaling peptide in Populus simonii×P.nigra

圖4 小黑楊ERF11蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測和分析Fig.4 Prediction and analysis of ERF11 protein transmembrane structure in Populus simonii×P.nigra

2.3 同源性分析

對ERF11氨基酸序列進行同源序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖5)。結(jié)果表明，17條蛋白序列大致可分為兩類：其中綠豆(Vignaradiatavar.radiata)、威氏大豆(Glycine)、赤豆(Vignaangularis)、花蕓豆(Phaseolusvulgaris)、木瓜(Caricapapaya)、枇杷樹(Eriobotryajaponica)、蘋果(Malusdomestica)、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)、橙子(Citrussinensis)、克萊門柚(Citrusclementina)聚成一個大類，與小黑楊ERF11基因親緣關系較遠；小黑楊(Populussimonii×P.nigra)、毛果楊(Populustrichocarpa)、胡楊(Euphratica)、蓖麻(Ricinuscommunis)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、木薯(Manihotesculenta)聚成一類，且親緣關系較近。

圖5 小黑楊ERF11系統(tǒng)進化樹Fig.5 Evolutionary tree of PsnERF11

圖6 ERF11蛋白亞細胞定位結(jié)果 A,D.暗場觀察；B,E.明場觀察；C,F.二者結(jié)合效果Fig.6 Subcellular localization of ERF11 protein A,D.Were observed in dark filed for green fluorescence；B,E.Were observed in bright field; C,F.Were observed in combination

2.4 基因在洋蔥表皮的瞬時表達

ERF11融合表達載體使用載體引物進行驗證，載體引物位于35 s啟動子及GFP序列兩端，條帶為1 800 bp左右，表明載體構(gòu)建成功。激光共聚焦顯微鏡下觀察(見圖6)，對照GFP空載體在整個洋蔥表皮細胞中均有表達，而ERF11-GFP融合表達載體只能在細胞核中看到綠色熒光，ERF11基因在細胞核中表達，與在線預測軟件Yloc預測分析結(jié)果一致。

2.5 ERF11基因差異表達分析

ERF11基因表達具有組織特異性，并受脅迫誘導表達。在非脅迫條件下，其在根中表達水平明顯比在莖和葉中的表達水平高，約為莖和葉中表達水平的4.7倍，而在莖和葉中的表達水平差異不大(見圖7)。甘露醇脅迫下，ERF11基因在根莖葉中的表達量均有先升高再降低的趨勢，根中24 h達到最大值，約為非脅迫對照表達水平的163.7倍；莖中12 h達到最大，約為非脅迫對照表達水平的4.9倍；在葉中9 h表達量達到最大值，為非脅迫對照表達水平的6.8倍(見圖8)。鹽脅迫下，ERF11基因在根莖葉中的表達同樣表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，根中12 h表達量達到最大，約為非脅迫對照表達水平的59.8倍，莖中9 h達到最大，約為非脅迫對照表達水平的2.4倍，葉中3 h達到最大，約為非脅迫對照表達水平的的4.8倍(見圖9)。

圖7 小黑楊ERF11基因0 h時不同部位相對表達量變化Fig.7 Changes of relative expression of ERF11 gene in different parts of Populus simonii×P.nigra at 0 h

圖8 小黑楊ERF11基因甘露醇模擬干旱處理下不同時間下不同部位相對表達量變化 a.根；b.莖；c.葉Fig.8 Changes of relative expression of ERF11 gene in different parts of Populus simonii×P.nigra under simulated drought a.Root; b.Stem; c.Leaf

圖9 小黑楊ERF11基因鹽脅迫處理下不同時間下不同部位相對表達量變化 a.根；b.莖；c.葉Fig.9 Changes of relative expression of ERF11 gene in different parts of Populus simonii×P.nigra under salt stress at different time a.Root; b.Stem; c.Leaf

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是一種可被真核生物基因啟動子序列中的順式作用元件識別，并能特異性結(jié)合的一類蛋白[18]。在植物的生長發(fā)育過程中，會受到各種生物、非生物脅迫，通過信號傳遞促使轉(zhuǎn)錄因子與下游順式作用元件結(jié)合，調(diào)控下游基因表達，對逆境做出響應，使植物對環(huán)境脅迫的適應能力增強。由不同轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡在抵御逆境脅迫中發(fā)揮了重要的作用[19]。

植物在受到外界逆境環(huán)境脅迫時，通過信號傳遞，使轉(zhuǎn)錄因子與下游基因的順式作用元件相結(jié)合調(diào)控下游基因，進而調(diào)控植物響應外界逆境環(huán)境，而轉(zhuǎn)錄調(diào)控已成為植物對逆境脅迫反應調(diào)控中的研究熱點[20～21]。滲透脅迫會導致植株水分向外倒流，引起生理干旱、細胞的滲透勢增加、氣孔導度下降及葉綠體受損，影響植物蒸騰作用，抑制植物生長甚至死亡[22～23]。AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生物、非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用[24～25]。迄今為止，已報道的ERF家族基因多數(shù)被低溫、干旱、鹽堿、病害、機械損傷等逆境或脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)等內(nèi)源激素誘導，參與不同的信號調(diào)節(jié)途徑。此外，研究發(fā)現(xiàn)，不同逆境環(huán)境、不同激素誘導的ERF家族成員也不同。擬南芥ERF1轉(zhuǎn)錄因子通過GCC-box和DRE元件結(jié)合應答干旱和高鹽脅迫[26]。小麥轉(zhuǎn)錄因子TaERF3基因的過表達植株抗旱、耐鹽能力顯著增加[27]。水稻OsEBP-89基因表達受到高鹽和2,4-D的調(diào)控[28]。番茄TSRF1基因可被乙烯、水楊酸以及病害誘導、SLERF5基因則響應高鹽和干旱脅迫[29～31]。AgDREB1和AgDREB2可能作為轉(zhuǎn)錄激活因子通過結(jié)合相應的DRE來調(diào)節(jié)下游基因，從而增強芹菜的抗應激能力[32]。

本研究中，從小黑楊葉中克隆出732 bp的ERF11基因，對該基因進行了生物信息學分析、親緣關系分析、亞細胞定位、時空表達分析。ERF11基因在應答高鹽干旱脅迫上具有明顯的組織特異性，在根中的相對表達量遠高于莖和葉。楊樹ERF11基因可能參與植物滲透脅迫，與增強植物抗逆性有關。