張 磊 熊歡歡 曹 慶 趙佳麗 張含國

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實驗室，哈爾濱 150040)

由于全球氣候的波動變化，各種極端氣候頻發(fā)，我國春旱災(zāi)害時有發(fā)生，嚴(yán)重限制了各地林業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。隨著生物技術(shù)尤其是基因工程技術(shù)的發(fā)展，物種間的遺傳界限逐步被打破，使得各類育種工作能夠通過基因工程的手段精準(zhǔn)、便捷、快速地實現(xiàn)育種目標(biāo)。利用生物技術(shù)或基因工程對林木進(jìn)行遺傳改良的基礎(chǔ)是遺傳轉(zhuǎn)化體系及對基因功能的了解[1～4]，這對開展落葉松分子育種十分必要。

NAC類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，多數(shù)研究表明NAC在植物抗逆和防衛(wèi)反應(yīng)中起到了重要作用[5～6]。長白落葉松作為我國東北地區(qū)主要針葉造林樹種，其基因功能研究較少，通過長白落葉松瞬時轉(zhuǎn)化NAC基因后對干旱脅迫生理指標(biāo)的變化可以推斷基因在抗逆方面是否具有一定的功能，為后期培育落葉松抗旱新品系提供優(yōu)良的基因，為加速落葉松分子育種進(jìn)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取飽滿的長白落葉松種子，用去離子水浸泡4～5 d，期間換水3～4次，播種于營養(yǎng)土基質(zhì)(粘土、蛭石、珍珠巖比例為5∶3∶2)中，1.0～1.5個月后，取針葉未完全展開的落葉松幼苗利用構(gòu)建好的pCAMBIA1301植物表達(dá)載體進(jìn)行瞬時侵染，獲得LoNAC18瞬時遺傳轉(zhuǎn)化的長白落葉松植株用于脅迫處理。

1.2 材料處理

配置30%(w/v)的PEG溶液，在瞬時遺傳轉(zhuǎn)化植株栽植在營養(yǎng)土中12 h后(記為T0)開始澆灌，同時以瞬時轉(zhuǎn)化空載體植株作為對照，分別于脅迫后0 h(T0)，24 h(T24)，48 h(T48)取整株材料作為試驗樣品，置于去離子水中洗去表面雜質(zhì)，吸干水分，液氮速凍后于-80℃冰箱中保存，提取RNA待用。

1.3 序列分析

將得到的基因序列利用NCBI進(jìn)行分析，確定保守結(jié)構(gòu)域，然后利用ExPASy提供的在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對氨基酸序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)預(yù)測，包括氨基酸長度、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)，利用網(wǎng)頁在線工具GOR4和SwissModle(網(wǎng)址為https://www.swissmodel.expasy.org/)分別預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)。

1.4 RT-PCR

以長白落葉松α-tubulin基因為內(nèi)參基因，根據(jù)基因序列設(shè)計定量引物序列為(5′—3′)為AAGCTGCAACTGCCCAAACT和TGCTGCTGTTTCCATTACCA。熒光定量PCR反應(yīng)體系為2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10.0 μL，10 μmol·L-1F和R引物各1.0 μL，Passive ReferenceDye(50×)(optinal)1.0 μL ,cDNA模板1.0 μL，加水補(bǔ)至20.0 μL。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 生理指標(biāo)測定

分別于脅迫后0 h(T0)，24 h(T24)，48 h(T48)取整株材料作為試驗樣品，進(jìn)行研磨，參照可溶性糖含量、丙二醛含量(malondiadehyde，MDA)、可溶性蛋白含量、過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性測定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC基因序列分析

根據(jù)前期長白落葉松在干旱脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得該條NAC全長基因序列，命名為LoNAC18，對該基因進(jìn)行基本分析結(jié)果表明：全長基因序列1 101 bp，具有NAC基因家族的NAM保守結(jié)構(gòu)域。與擬南芥的NAC基因家族序列比對結(jié)果表明，相似度最高的是AtNAC018和AtNAC056。

利用Protparam蛋白的理化性質(zhì)及親水性進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)LoNAC18為不穩(wěn)定的親水性蛋白，其二級結(jié)構(gòu)表明蛋白以隨機(jī)卷曲為主，含有17.21%的α-螺旋，21.31%的延伸鏈以及61.48%的無規(guī)則卷曲(如圖3所示)。利用同源建模法預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)(如圖4所示)。

2.2 瞬時轉(zhuǎn)化植株的驗證

經(jīng)過RT-PCR檢驗基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，瞬時遺傳轉(zhuǎn)化的長白落葉松過表達(dá)幼苗的NAC基因表達(dá)量有顯著性增加。說明通過瞬時遺傳轉(zhuǎn)化后基因的表達(dá)量發(fā)生變化，可用于基因功能的初步研究。在PEG模擬干旱脅迫的條件下，NAC基因表達(dá)量從脅迫0 h到脅迫48 h呈上升趨勢，且在脅迫48 h達(dá)到最大值。轉(zhuǎn)化植株在PEG脅迫條件下的基因表達(dá)量較未脅迫的同一時期的植株發(fā)生上調(diào)，說明NAC基因可以被PEG模擬的干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，NAC基因可能參與調(diào)控長白落葉松對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

表1 LoNAC18氨基酸序列理化性質(zhì)分析

圖1 NAC基因的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 NAC conserved domain database

圖2 長白落葉松NAC基因與擬南芥NAC基因家族的序列比對Fig.2 NAC Sequence alignment between Larix olgensis and Arabidopsis thaliana family

圖3 長白落葉松蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 豎長線(藍(lán)色)代表螺旋；豎中線(紅色)代表折疊；豎短線(紫色)代表卷曲Fig.3 Secondary structure of larch protein Vertical line(blue) represents spiral; Vertical midline(red) represents folding; Short vertical lines(purple) represent curls

圖4 長白落葉松蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of larch protein

圖5 瞬時轉(zhuǎn)化植株NAC基因表達(dá)量分析Fig.5 Analysis of NAC gene expression in transient transformed plants

圖6 PEG模擬干旱脅迫瞬時轉(zhuǎn)化植株NAC基因表達(dá)量分析Fig.6 NAC gene expression of transformed plants under PEG stress

圖7 瞬時轉(zhuǎn)化植株在干旱脅迫下SOD活性的變化Fig.7 SOD activity in transient transformed plants under drought stress

圖8 瞬時轉(zhuǎn)化植株在干旱脅迫下POD活性的變化Fig.8 POD activity in transient transformed plants under drought stress

圖9 瞬時轉(zhuǎn)化植株在干旱脅迫下MDA含量的變化Fig.9 MDA content in transient transformed plants under drought stress

圖10 瞬時轉(zhuǎn)化植株在干旱脅迫下可溶性糖含量的變化Fig.10 Soluble sugar content in transient transformed plants under drought stress

圖11 瞬時轉(zhuǎn)化植株在干旱脅迫下可溶性蛋白含量的變化Fig.11 Soluble protein content in transient transformed plants under drought stress

2.3 瞬轉(zhuǎn)植株在PEG脅迫下的生理指標(biāo)變化

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性

當(dāng)植物受到生物或者非生物性逆境脅迫時，植物中的抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)過度表達(dá)。其中SOD可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜膜質(zhì)之中的氧化反應(yīng)，與POD在植物的抗逆性生長發(fā)育中起著重要的作用，可以提高植物的抗逆性。

長白落葉松植株瞬時轉(zhuǎn)化NAC基因后，在干旱脅迫條件下SOD酶活性呈現(xiàn)上升趨勢(如圖7所示)。

與對照植株中的活性相比，在干旱脅迫開始后瞬時轉(zhuǎn)化植株的SOD酶活性均高于對照，且在48時達(dá)到最大值。瞬時轉(zhuǎn)化NAC基因的長白落葉松植株SOD活性與未脅迫時相比，在24 h增加38.46%，48 h增加56.33%。T24和T48脅迫后的轉(zhuǎn)基因植株與同時期對照相比，SOD活性分別為13.85%和10.37%。

2.3.2 過氧化物酶(POD)活性

POD是過氧化物酶，可以催化氫氧化物和過氧化氫反應(yīng)轉(zhuǎn)化為醌類且可以促進(jìn)植物木質(zhì)化。干旱脅迫之下，長白落葉松植株之中的POD活性隨著脅迫時間的增長而逐漸增加(如圖8所示)，且增加幅度均大于對照，但差異不明顯。

瞬轉(zhuǎn)NAC基因的長白落葉松植株P(guān)OD活性在脅迫48 h后達(dá)到最大，與未脅迫時相比，T48比T0和T24樣品的POD活性分別提高46.95%和9.62%。而脅迫24和48 h的瞬時轉(zhuǎn)化植株與對照相比分別只提高了3.31%和3.27%。

2.3.3 丙二醛(MDA)含量

MDA是植物在遭遇逆境脅迫下產(chǎn)生的，其在植物體內(nèi)的含量隨逆境脅迫時間和脅迫程度的變化而變化。因此，MDA也可以作為研究植物生理和生態(tài)變化的一項重要生理指標(biāo)。

從脅迫開始，對照植株與瞬轉(zhuǎn)植株的MDA含量均呈現(xiàn)上升趨勢(如圖9所示)，表明所有植株都受到干旱脅迫的影響，體內(nèi)的MDA含量逐漸增加。

在脅迫開始時和脅迫24 h時，瞬時轉(zhuǎn)化NAC的落葉松植株的MDA含量大致相同，沒有出現(xiàn)顯著差異。在脅迫開始后，對照植株與瞬轉(zhuǎn)植株的MDA含量均大幅度上升，在48 h到達(dá)最大值，但瞬時轉(zhuǎn)化植株MDA上升幅度小于對照植株。對照植株的脅迫48 h與脅迫24 h的MDA含量與未脅迫時相比分別增加了87.62%和33.56%，而同時期瞬轉(zhuǎn)NAC植株的MDA含量與未脅迫相比增加了50.12%和20.28%。所以瞬轉(zhuǎn)植株累計的MDA含量明顯小于對照植株，說明其受到脅迫影響較小。

2.3.4 可溶性糖含量

可溶性糖儲存能量并為植物的生長發(fā)育做能量準(zhǔn)備。植物在遭受干旱、高溫等逆境脅迫時，其體內(nèi)的可溶性糖含量會增加，植物的抗逆機(jī)制將被觸發(fā)，以防止植物受到更多的損害。

在干旱脅迫下，對照植株的可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而瞬轉(zhuǎn)植株的可溶性糖含量在脅迫24 h之內(nèi)幾乎沒有變化，在脅迫48 h時顯著增加(如圖10所示)。

在脅迫24 h，對照的可溶性糖含量分別比對照和脅迫48 h高出49.95%和19.82%。脅迫48 h的瞬轉(zhuǎn)植株可溶性糖含量與T0和T24相比分別高出30.82%和25.03%，相比同時期對照可溶性糖含量高出16.65%。

2.3.5 可溶性蛋白含量

可溶性蛋白作為植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其含量的增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。因此，可溶性蛋白的含量也可以作為測定植物抗逆能力的一項重要指標(biāo)。

在干旱脅迫下，瞬轉(zhuǎn)植株與對照植株的可溶性蛋白質(zhì)含量隨著脅迫時間的增長而不斷上升(如圖11所示)。與對照相比，瞬轉(zhuǎn)植株的可溶性蛋白含量上升趨勢高于對照。瞬轉(zhuǎn)植株脅迫24和48 h的可溶性蛋白含量與未脅迫時相比分別提高66.89%和120.81%，與對照同時期相比分別高出9.2%和30.3%。而瞬轉(zhuǎn)LoNAC8的植株脅迫24和48 h的可溶性蛋白含量與未脅迫時相比分別提高72.3%和147.6%，與對照同時期相比分別高出25.14%和41.51%。

3 討論

當(dāng)植物受到干旱脅迫時，一般會通過減少細(xì)胞內(nèi)的水分含量、縮小細(xì)胞的體積、增加細(xì)胞內(nèi)可溶解物質(zhì)的含量等途徑，降低細(xì)胞滲透勢，防止細(xì)胞過度失水，從而維持植物的正常生命活動[7～8]。NAC類轉(zhuǎn)錄因子是植物中所特有的，有研究指出NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的抗逆和防衛(wèi)反應(yīng)[6]。比如在柑橘[9]、毛竹等均發(fā)現(xiàn)了能夠響應(yīng)干旱脅迫的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族[10]?？扇苄蕴呛?、可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD活性、POD活性均呈現(xiàn)上升趨勢是植物在受到干旱脅迫后的普遍變化[11～13]。

Tran等[14]證明擬南芥的ANAC019，ANAC055和ANAC072基因的表達(dá)受干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)，超表達(dá)這3個基因能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱能力。Hu等[15]發(fā)現(xiàn)水稻中的SNAC1基因能夠被干旱和鹽脅迫所誘導(dǎo)，將該基因在水稻中超表達(dá)可以明顯提高轉(zhuǎn)基因植株對干旱、高鹽的耐受性。還有大量的研究證實柑橘中的NAC83[9]、毛竹中的PeNAC1～PeNAC7等均能夠響應(yīng)干旱脅迫[10]，在脅迫后被誘導(dǎo)高表達(dá)時基因參與調(diào)控的顯著特征之一。有研究表明擬南芥NAC018蛋白及其編碼基因具備耐干旱和耐鹽性及延緩衰老的作用[16]，LoNAC18與擬南芥NAC018基因序列相似度最高，推測其具有類似的功能或作用。

為初步驗證長白落葉松NAC基因是否參與調(diào)控長白落葉松對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，對瞬時轉(zhuǎn)化后的植株進(jìn)行PEG干旱脅迫，分析轉(zhuǎn)化后植株在不同時間的基因表達(dá)量變化，結(jié)合轉(zhuǎn)化后植株的可溶性糖、可溶性蛋白、SOD、POD、MDA等生理生化指標(biāo)分析。分析結(jié)果可知，瞬時轉(zhuǎn)化NAC基因的長白落葉松在PEG模擬干旱脅迫條件下，NAC基因表達(dá)量上調(diào)，與對照相比，SOD和POD活性都有所增加，MDA含量累計程度低于對照，可溶性蛋白含量增加，可溶性糖含量在脅迫48 h時高于對照，說明NAC基因在一定程度上參與調(diào)控了長白落葉松應(yīng)答PEG模擬干旱脅迫的過程，其參與調(diào)控的代謝通路有待進(jìn)一步研究。