侯雪月 鄧俊杰 姚志紅 黃壽臣 李嘉哲 茶新有 馬德志 張榮沭*

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院黃芪產(chǎn)業(yè)研究院，齊齊哈爾 161000)

蕓芥(ErucasativaMill.)又稱芝麻菜，是十字花科(Brassicaceae)芝麻菜屬(Eruca)的一年生草本植物。株形緊湊、營養(yǎng)豐富，經(jīng)常食用能補(bǔ)鈣、增強(qiáng)免疫力、提高肝臟的排毒功能和降低血液中的膽固醇含量[1]。蕓芥主要分布在我國西北、華北以及四川、甘肅、新疆等地[2]，是一類極具利用價值的野生鄉(xiāng)土植物資源，現(xiàn)今國內(nèi)外最為推崇的保健新蔬。

木霉菌(Trichodermaspp.)廣泛分布于土壤和根際生態(tài)系統(tǒng)，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長速度快[3]。木霉菌能定殖于植物的根際，與植物根系形成共生體，來改變其代謝功能，表現(xiàn)在可促進(jìn)植物生長、增加養(yǎng)分吸收、提高農(nóng)作物產(chǎn)量等方面[4]。研究證明深綠木霉菌絲體和孢子均能顯著促進(jìn)青蒿幼苗生長[5]；經(jīng)誘變選育的高效溶磷木霉可顯著提高番茄幼苗的株高、根長、莖粗、地上部干質(zhì)量、地下部干質(zhì)量等生物量指標(biāo)，較CK相比可增長40%左右[6]。此外，木霉菌能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。木霉稀釋發(fā)酵液能明顯提高白菜、菠菜和辣椒體內(nèi)的脯氨酸含量和過氧化物酶活性[7]，因此，木霉菌是現(xiàn)今極受關(guān)注的一種生防菌肥。

光合作用是植物有機(jī)物積累的重要過程，光合作用效率被認(rèn)為是影響植物生長的重要因素[8～9]。研究認(rèn)為木霉菌能增強(qiáng)植株的光合作用以促進(jìn)植物有機(jī)物的積累[10～11]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)山新楊施用棘孢木霉其光合—光響應(yīng)能力顯著提升[12]；哈茨木霉接種濕地松幼苗顯著地增加其凈光合速率和蒸騰速率,同時顯著降低氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳的濃度[13]；木霉菌還可通過調(diào)節(jié)玉米幼苗的光合作用來減輕其鹽堿脅迫危害[14]。然而，木霉菌對蕓芥生長、光合特性、抗性和營養(yǎng)品質(zhì)的研究尚未明確。因此，筆者采用本實驗室分離鑒定的哈茨木霉T8對蕓芥進(jìn)行大田浸種和澆根處理，通過分析大田條件下在一個生長季內(nèi)木霉菌對種植三茬30 d齡蕓芥的生理指標(biāo)的影響，以期研制出提高蕓芥產(chǎn)量和品質(zhì)的生防木霉菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為哈茨木霉T8(TrichodermaharzianumT8)，由東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院園林植物應(yīng)用實驗室分離鑒定并保存，無菌條件下采用PDA培養(yǎng)基接種活化的菌株，獲得大量木霉分生孢子，用去離子水配制木霉分生孢子懸浮液。

供試植物為蕓芥(芝麻菜)，購于吉林省扶余市益農(nóng)蔬菜種子商店。試驗于黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)苗圃大田進(jìn)行，分3個時間段進(jìn)行播種，播種時間分別為2018年5月22日、2018年7月5日和2018年8月18日?？傇囼灻娣e為135 m2。

1.2 試驗方法

蕓芥的種子進(jìn)行如下兩種預(yù)處理：處理組(T8)采用木霉分生孢子懸浮液浸泡，對照組的種子采用溫水浸泡，浸泡時長均為24 h。并將木霉菌液(對照組CK用等量自來水)按照1×1014cfu/kg土均勻拌入干燥大田細(xì)土中。

將浸泡后的蕓芥種子均勻播于東北林業(yè)大學(xué)苗圃大田上，其中CK組67.5 m2(每次處理15 m×0.5 m×3 m；3個生物學(xué)重復(fù))；T8組67.5 m2，保持土壤濕潤，其他培養(yǎng)條件保持一致。在單位面積發(fā)芽率達(dá)90%時進(jìn)行記錄生長期，當(dāng)生長30 d時，分別于2018年6月22日，2018年8月5日，2018年9月18日在T8和CK組中各隨機(jī)選取3株長勢一致的蕓芥幼苗，每株苗選擇3片成熟健康的頂生葉片，進(jìn)行蕓芥光合特性的測定，并取樣進(jìn)行其他生理指標(biāo)檢測。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長量指標(biāo)的測定

于采收期隨機(jī)選取各實驗組蕓芥進(jìn)行根長、鮮重生長指標(biāo)的測定。再將其各組織部位殺青后烘干至恒重，稱量干重。

1.3.2 光合日變化測定

測定在無風(fēng)，光線充足的天氣下進(jìn)行。采用LI-6400XT便攜式光合儀，在08:00～16:00，自然光照下，每隔2 h檢測凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Cond)和胞間CO2濃度(Ci)四個光合指標(biāo)。

1.3.3 抗性相關(guān)指標(biāo)測定

超氧化物歧化酶SOD的活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[15]測定；過氧化物酶POD的活性采用愈創(chuàng)木酚法[15]測定；過氧化氫酶CAT的活性采用紫外吸收法[15]測定；多酚氧化酶PPO的活性采用鄰苯二酚法[15]測定；游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法[16]測定。

1.3.4 營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)測定

采用分光光度法測定葉綠素含量[17]；可溶性糖的含量采用蒽酮比色法測定[18]；可溶性蛋白質(zhì)的含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2007軟件包和Minitab 16統(tǒng)計軟件包對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。對同一時間點的T8與CK組的差異顯著性進(jìn)行ANOVA分析，在P<0.05下比較差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對蕓芥幼苗生長的影響

三茬蕓芥的物質(zhì)積累量測量結(jié)果見表1。在種植的每一茬中，T8組無論是葉鮮重、葉干重還是根鮮重、根干重、根長指標(biāo)多顯著高于CK組(P<0.05；第一茬根長指標(biāo)除外)。

表1 蕓芥葉和根的指標(biāo)測定

注：圖中不同小寫英文字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。

Note:Different lowercase English letters indicate significant differences at 0.05 level,the same as below.

表2 蕓芥抗性相關(guān)酶活性

圖1 蕓芥Pn、Tr、Cond和Ci的日變化Fig.1 Diurnal variation of Pn,Tr,Cond and Ci on rocketsalad

表3 蕓芥可溶性糖和可溶性蛋白含量

2.2 蕓芥葉片光合日變化動態(tài)因子分析

由圖1a可見，木霉處理提高了三茬蕓芥的凈光合速率(Pn)。T8與CK組蕓芥的Pn日變化趨勢一致，均是先升高后下降，單峰值都出現(xiàn)在正午12:00，并且Pn第一茬>Pn第二茬>Pn第三茬。

與蕓芥Pn日變化曲線相似，蕓芥的蒸騰速率(Tr)曲線變化也呈單峰形，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，且三茬試驗中TrCK均低于TrT8(見圖1b)。

蕓芥第一茬T8和CK組的氣孔導(dǎo)度(Cond)變化都較為平穩(wěn)(見圖1c)，T8組都明顯高于CK組(P<0.05)；但第二、第三茬時，CK組的Cond卻略高于T8組(僅在第二茬中，在12:00～14:00某一時刻之后，T組的Cond開始高于CK組)。

T8與CK組蕓芥葉片胞間CO2濃度(Ci)日變化趨勢一致，先降低后上升，呈“V”字型(第二茬CK組除外，但不顯著)(見圖1d)。在蕓芥的三茬連種試驗中，第一和第三茬蕓芥T8與CK組的Ci均在中午12:00處于最低值，第二茬蕓芥CK組的Ci在中午12:00達(dá)到最低值，T8組卻在早上10:00達(dá)到最低值。但T8組蕓芥的Ci均低于同茬CK組。

2.3 對蕓芥抗性相關(guān)指標(biāo)的影響

SOD、POD、CAT、PPO和脯氨酸與植物抗性相關(guān)。由表2可見，兩組蕓芥葉片的SOD和PPO活性第一茬時均無顯著差異，但在第二茬時T8組的SOD活性顯著高于CK組(P<0.05)，第三茬時T8組的這兩個指標(biāo)均顯著高于CK(P<0.05)。POD活性和CAT活性不同時期的變化完全相反，第一茬中蕓芥CK組的POD活性顯著高于T8組(P<0.05)，T8組的CAT活性顯著高于CK組(P<0.05)，但在第三茬時T8組POD活性顯著高于CK組(P<0.05)，CK組的CAT活性顯著高于T8組(P<0.05)。脯氨酸含量變化與PPO活性趨勢相同，到第三茬時T8組才顯著高于CK組(P<0.05)。

2.4 對蕓芥營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的影響

三茬蕓芥的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)測定結(jié)果見表3：不同時期T8組蕓芥葉片的葉綠素含量、可溶性糖和可溶性蛋白均顯著高于同期CK組(P<0.05)。

3 討論

本研究進(jìn)行蕓芥木霉和無木霉處理的大田試驗，通過分析其在一個生長季連種三茬的生長相關(guān)生理指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)木霉處理組蕓芥在生物量、光合能力、防御酶活性、脯氨酸含量和營養(yǎng)指標(biāo)上均有一定的改善，具體表現(xiàn)在：

(1)生物量是最直接反映蕓芥生理特性的重要指標(biāo)。本研究表明，木霉T8組中，無論是葉鮮/干重還是根鮮/干重指標(biāo)均顯著高于同茬的CK組(P<0.05；第一茬和第二茬葉長除外)。這說明，木霉處理能夠增強(qiáng)蕓芥的生物量，從而提高其產(chǎn)量。根長反映植株蓄水保水能力強(qiáng)弱。本研究還發(fā)現(xiàn)T8組根長在后兩茬中顯著高于同期的CK組(P<0.05)，這表明木霉能夠促進(jìn)蕓芥的蓄、保水能力，從而調(diào)控其生長。

(2)本試驗發(fā)現(xiàn)木霉菌能在一定程度上提高蕓芥的凈光合速率，降低其蒸騰速率，調(diào)整胞間CO2濃度。光合作用是植物賴以生存的基礎(chǔ)，同時對環(huán)境條件的變化十分敏感。與第一茬蕓芥相比，午后16:00時第二、第三茬蕓芥的T8組和CK組的Pn均明顯降低，其主要原因可能是由于種植地附近有高大建筑物，在秋季午后對種植地有遮擋，故會出現(xiàn)急劇下降的趨勢。三茬試驗中TrCK均低于TrT8，表明在適量的木霉菌誘導(dǎo)下可改善蕓芥對水分的蒸發(fā)能力。植物一直是通過改變氣孔數(shù)目和開閉程度來調(diào)節(jié)葉片的蒸騰速率和水勢，并且光合作用和干物質(zhì)積累所需要的二氧化碳也是通過氣孔獲得，所以氣孔在調(diào)控水分丟失和光合作用之間總是處于一種折中狀態(tài)。在第一茬時T8組的氣孔導(dǎo)度明顯高于CK組，與其相比，第二和第三茬的T8組較CK組Cond值下降得更快、更低，其最有可能的原因的是由于天氣溫度逐漸升高，蕓芥本身為了避免水分過度缺失降低其氣孔導(dǎo)度，木霉菌增強(qiáng)了這一特性。但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

(3)SOD、POD、CAT和PPO是植物體內(nèi)抗性相關(guān)的4類酶[20]，這些酶通常在植物抵御外界病原菌及不良條件時發(fā)揮重要作用。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)[21]。POD是一類活性較高的酶，與植物的呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系[22]。CAT是植物體內(nèi)最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用[23]。PPO可通過催化木質(zhì)素及醌類化合物形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌的侵害，也可通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病防蟲作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)木霉處理的蕓芥的抗氧化酶活性和脯氨酸含量均有一定程度上的提高，或許與木霉誘導(dǎo)植物提高局部和系統(tǒng)抗性有關(guān)，其調(diào)控機(jī)制有待于后期深入研究。

(4)葉綠素含量是評估植物營養(yǎng)和生長狀況的重要指標(biāo)。在植物同化物積累期間，葉片的葉綠素水平與光合強(qiáng)度呈正相關(guān)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)T8組蕓芥的葉綠素含量顯著高于CK組(P<0.05)，這說明木霉能通過提高蕓芥體內(nèi)的葉綠素含量，從而改善其光合作用能力。另一方面，葉綠素具有改善便秘、降低膽固醇、抗衰老、排毒消炎、脫臭、抗癌抗突變等功能；葉綠素還可以防治感冒；增強(qiáng)記憶力[26]。此外，可溶性糖和可溶性蛋白作為植物體內(nèi)主要的碳素和氮素的存在形式，也是兩項重要的評價植物營養(yǎng)品質(zhì)的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，蕓芥幼苗T8組葉片的可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著提高，說明木霉能夠提高蕓芥的營養(yǎng)品質(zhì)，并增強(qiáng)其口感。總之，本研究結(jié)果為研制提高蕓芥產(chǎn)量和品質(zhì)的木霉生防菌劑提供了理論依據(jù)。