羅燕 陳志濤 徐崇明 張曲

(1湖北省腫瘤醫(yī)院腹部放療科 湖北省結(jié)直腸癌臨床醫(yī)學研究中心 武漢市結(jié)直腸癌臨床醫(yī)學研究中心，湖北 武漢 430079；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院消化內(nèi)科)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)相關(guān)結(jié)直腸癌(UCRCC)是UC嚴重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率雖然僅占UC的1.2%～4.3%，但是卻占UC死亡例數(shù)的15%〔1,2〕。研究表明，UC發(fā)展為UCRCC最經(jīng)典的模式為“炎癥→不典型增生→惡性病變”，其中不典型增生是UCRCC發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔3〕。阻斷UC向UCRCC演變已成為結(jié)直腸癌早期防治的主要內(nèi)容。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是細胞一個基本病理生理現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、干細胞增殖轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用〔4〕。EMT是“炎性→癌變”的橋梁，針對EMT調(diào)控的研究，極有可能為防治非可控性炎癥和相關(guān)腫瘤提供新的途徑〔5〕。結(jié)直腸癌組織和細胞上皮標志物E-cadherin蛋白表達下調(diào)，而間質(zhì)標志物N-cadherin和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β蛋白表達上調(diào)，提示EMT與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展有關(guān)〔6〕。但是EMT是否參與了UC→UCRCC過程及相關(guān)的調(diào)控機制，仍需要深入研究。miR-19a是近年發(fā)現(xiàn)與UC有關(guān)的miRNA，在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型大鼠腸黏膜中miR-19a明顯增加〔7,8〕；上調(diào)結(jié)腸直腸癌細胞miR-19a表達可促進細胞的增殖和侵襲〔9〕。但是miR-19a對UCRCC的影響及相關(guān)作用機制依然未見報道。本研究通過氧化偶氮甲烷(AOM)/DSS建立UCRCC小鼠模型，利用miR-19a反義寡核苷酸慢病毒載體進行干預(yù)，旨在探討miR-19a對UCRCC的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 40只雄性C57BL/6J小鼠(6～8周齡)購自武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心〔許可證號：SYXK(鄂)2015-0025〕。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級，恒溫(22±2)℃、恒濕(50%～70%)，晝夜交替光照(12 h照明/12 h黑暗)，自由進食和飲水。本研究使用的動物嚴格按照國家《實驗動物福利倫理審查指南》和《湖北省實驗動物管理條例》相關(guān)要求。

1.2實驗試劑 AOM購自美國Sigma公司(純度99.5%)，DSS購自美國MP Biochemicals公司(純度99.2%)。miR-19a反義寡核苷酸慢病毒載體及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，miR-19a引物購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，Taqman miRNA Reverse Transcription Kit購自美國Applied Biosystems公司，E-cadherin單克隆抗體、N-cadherin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3UCRCC模型制備 小鼠單次腹腔注射劑量為12 mg/mg的AOM，AOM注射1 w后，小鼠飲用含3.5% DSS飲用水1 w，之后飲用正常無菌水2 w；接下來循環(huán)重復(fù)DSS誘導(dǎo)2次，造模過程中小鼠自由進食，模型給藥方案見圖1。

圖1 UCRCC小鼠模型給藥計劃

1.4分組處理 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為4組：模型組、AS-miR-19a組、陰性對照組和正常對照組，每組10只小鼠。模型組、AS-miR-19a組、陰性對照組建立UCRCC小鼠模型，AS-miR-19a組于第7周(第2次DSS誘導(dǎo)后2 w)經(jīng)結(jié)腸灌注100 μl濃度為1×109TU/ml的miR-19a反義寡核苷酸腺病毒載體，AS-miR-19a腺病毒載體由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成(5′-UCAGUUUUGCAUAGAUUUGCACA-3′)。陰性對照組結(jié)腸灌注等量的miR-19a陰性對照腺病毒載體，陰性對照為miR-19a無義序列寡核苷酸(5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3′)。模型組灌注等量的生理鹽水。正常對照組小鼠不做任何處理，自由進食進水。

1.5小鼠一般情況評估 實驗開始后，每日記錄小鼠外觀、行為、體質(zhì)量、進食和進水量等，同時記錄小鼠糞便性狀及膿血便情況等。

1.6結(jié)腸組織取材 第11周，小鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉后，立即脫頸椎處死小鼠。超凈臺上解剖腹腔，取出肛緣至回盲部結(jié)腸，測量結(jié)腸的重量和長度?？v向切開結(jié)腸，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈，肉眼和顯微鏡下觀察黏膜水腫、糜爛和成瘤情況。

1.7結(jié)腸組織蘇木素-伊紅(HE)染色 用眼科剪將結(jié)腸組織剪成小塊，10%甲醛固定(pH7.4)，脫水、石蠟包埋，制成4 μm的切片。切片60℃烤10 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色，伊紅復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.8實時定量PCR檢測組織miR-19a表達 將結(jié)腸組織剪成小塊置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，再加入Trizol試劑盒提供總RNA。以U6為內(nèi)參，按照Taqman miRNA Reverse Transcription Kit說明書進行操作。miR-19a上游： 5′-CCGCTAATACTGCCTGGTAATG-3′，下游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCA-3′；U6上游：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′ ，下游：5′-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3′。采用兩步法進行PCR擴增，并制作標準曲線。PCR反應(yīng)條件：95℃，5 s，60℃，45 s，共計45個循環(huán)。溶解曲線為95℃，15 s，60℃，30 s，95℃，15 s。按照2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.9免疫組織化學染色 石蠟包埋的樣本組織經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；加入檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)加熱30 min修復(fù)抗原，3%過氧化氫(H2O2)孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，加入5%山羊血清封閉2 h。樣本組織加入E-cadherin(1∶100)和N-cadherin(1∶100)抗體4℃孵育過夜，次日再加入二抗孵育1 h，然后光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.10Western印跡檢測 將腫瘤組織剪成小塊置于研磨中，研成粉末后加入放射性免疫沉淀法(RIPA)裂解液，提取總蛋白；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測蛋白含量。40 μg總蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后加入含有5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1.5 h，PBS沖洗2遍，加入E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶300)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜。次日PBS沖洗3遍，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗鼠二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，PBS洗滌后ECL顯影，以GAPDH為內(nèi)參，Image J 掃描蛋白灰度值。目的蛋白相對灰度值=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.11統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件、GraphPad Prism7.0軟件和Adobe Photoshop CS6軟件進行數(shù)據(jù)和圖形處理。計量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；不同時間點采用重復(fù)測量方差分析。Kaplan-Meier法繪制各組小鼠實驗期間生存曲線，各組間生存率比較采用Log-rank法。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般情況觀察 小鼠腹腔注射AOM后第3天，開始出現(xiàn)慵懶、厭食、大便增多、稀便情況，注射第9天癥狀表現(xiàn)至高峰。第1次DSS誘導(dǎo)后第2天，小鼠表現(xiàn)為懶動、厭食和出現(xiàn)稀便，1 w后小鼠體質(zhì)量明顯減少，肉眼可見膿血便。4 w后老鼠出現(xiàn)死亡。AS-miR-19a組結(jié)腸灌注AS-miR-19a慢病毒第5天，癥狀明顯緩解。正常對照組小鼠飲食、活動正常，反應(yīng)機敏，毛發(fā)有光澤，無大便增多和稀便、便血等情況。至實驗第11周處死前，正常對照組無小鼠死亡，AS-miR-19a組小鼠死亡1只，模型組死亡4只，陰性對照組死亡3只，模型組和陰性對照組存活率明顯低于正常對照組和AS-miR-19a組(Log rank=4.764,7.228,3.357,4.832，均P<0.05)。第4周開始，正常對照組小鼠體重明顯高于AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組；第8周開始，AS-miR-19a組小鼠體重明顯高于模型組和陰性對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 UCRCC小鼠體重的變化(g)

與正常對照組比較：1)P<0.05，與AS-miR-19a組比較:2)P<0.05；下表同

2.2miR-19a對AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎癥的影響 正常對照組小鼠組織切片可見細胞核大，且分裂相對多，未見組織壞死和炎癥區(qū)域；模型組和陰性對照組可見大量壞死區(qū)域，炎性浸潤嚴重；AS-miR-19a組炎性反應(yīng)較模型組和陰性對照組明顯減輕，見圖2。

2.3miR-19a對AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸長度、成瘤數(shù)量的影響 與正常對照組比較，模型組和陰性對照組miR-19a表達明顯增加，AS-miR-19a組miR-19a表達顯著降低(均P<0.05)。AS-miR-19a組小鼠結(jié)腸成瘤數(shù)量明顯低于模型組和陰性對照組(均P<0.05)。AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組小鼠結(jié)腸長度較正常對照組明顯縮短，AS-miR-19a組結(jié)腸長度明顯長于模型組和陰性對照組(均P<0.05)，見表2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×100)

2.4免疫組織化學染色檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達 結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin蛋白均為染色為棕褐色，E-cadherin在AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組表達信號強度明顯低于正常對照組，AS-miR-19a組表達信號強度明顯高于模型組和陰性對照組。N-cadherin在AS-miR-19a組、模型組和陰性對照組表達信號強度明顯高于正常對照組，AS-miR-19a組表達信號強度明顯低于模型組和陰性對照組，見圖3。

2.5Western印跡檢測 與正常對照組比較，AS-miR-19a組，模型組和陰性對照組E-cadherin蛋白表達明顯降低，N-cadherin蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與AS-miR-19a組比較，模型組和陰性對照組E-cadherin蛋白表達顯著降低，N-cadherin蛋白表達顯著升高(均P<0.05)，見表3。

表2 miR-19a對UCRCC小鼠成瘤個數(shù)、 結(jié)腸長度的影響

圖3 免疫組織化學染色檢測小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(×100)

表3 各組小鼠結(jié)腸組織E-cadherin、 N-cadherin蛋白表達

3 討 論

UC與結(jié)直腸癌的癌前狀態(tài)密切相關(guān)〔10〕。由于UC發(fā)展至UCRCC是一個稽延事件，這亦為早期防治結(jié)直腸癌提供了機會。正常組織從癌前狀態(tài)發(fā)展為惡性腫瘤是一個多基因調(diào)控過程，多數(shù)腫瘤細胞不具有轉(zhuǎn)移能力，但EMT導(dǎo)致細胞骨架重構(gòu)和破壞細胞間粘連，使上皮細胞表現(xiàn)轉(zhuǎn)化為間葉細胞表型，進而誘導(dǎo)腫瘤的原位侵襲和轉(zhuǎn)移形成新病灶〔11〕。目前在UCRCC中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了EMT現(xiàn)象，EMT理論也很好地解釋了UC作為結(jié)直腸癌危險因素和癌前病變的原因。AOM/DSS誘導(dǎo)UCRCC模型小鼠結(jié)腸組織TNF-α、Snail表達明顯下調(diào)，并且結(jié)腸組織間質(zhì)表型標志物表達水平與炎癥因子正相關(guān)〔12〕。TNF-α可促進人結(jié)腸癌HCT116細胞E-cadherin表達減少和N-cadherin表達增加，誘導(dǎo)細胞EMT過程，并介導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移〔13〕。 miR-19a是近年來發(fā)現(xiàn)的致癌性miRNA，在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達增加，并且與腫瘤細胞遠處轉(zhuǎn)移和浸潤侵襲密切相關(guān)〔14〕。生物信息學分析顯示，miR-19a與腫瘤壞死因子(TNF)-α的3′UTR區(qū)域有匹配性，證實了miR-19a對TNF-α的調(diào)控作用〔15〕。陳淑蘭等〔16〕報道稱miR-19a高表達與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和細胞對5-氟尿嘧啶耐藥有關(guān)。本研究提示miR-19a可能與UC和UCRCC發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果說明抑制miR-19a表達阻斷UC的非可控性炎癥反應(yīng)，這對進一步阻斷“炎性→癌變”奠定了病理學基礎(chǔ)。周鵬志等〔17〕證實DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠miR-19a表達增加，中藥白頭翁可能通過調(diào)節(jié)miR-19a表達，發(fā)揮緩解炎癥反應(yīng)、改善UC病情的作用。本研究結(jié)果提示抑制miR-19a表達可以阻斷UC向UCRCC的發(fā)展，這為結(jié)腸癌的早期防治提供了一個非常有價值的作用靶點。 miRNA是EMT重要的調(diào)控因子，不同miRNAs在EMT中起的作用也不一樣。如miRNA-200家族成員可以下調(diào)間質(zhì)標志物和上調(diào)上皮標志物表達，抑制EMT發(fā)生〔18〕。miR-155則通過抑制E-cadherin表達，破壞細胞間的粘連，促進細胞遷移，誘發(fā)EMT〔19〕。本研究結(jié)果說明AOM/DSS誘導(dǎo)EMT小鼠模型發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，這與Findlay等〔20〕報道結(jié)論一致。利用miR-19a反義寡核苷酸下調(diào)小鼠結(jié)腸組織miR-19a表達，小鼠E-cadherin表達增加，N-cadherin表達相應(yīng)減少，提示下調(diào)miR-19a表達可能通過阻斷EMT過程抑制UCRCC的發(fā)生。本研究只是初步驗證了miR-19a可能是通過EMT調(diào)控UCRCC的發(fā)生，其具體作用機制還需要深入研究。