廖維勇，王 勇，黃文君，唐名杰

（1.桂林醫(yī)學院生理教研室，2.桂林市婦女兒童醫(yī)院腫瘤科，廣西桂林 541500）

泰素是治療實體瘤的一線抗腫瘤藥物，長期使用泰素可導致患者出現(xiàn)痛性神經(jīng)病變，主要表現(xiàn)為痛覺過敏或自發(fā)性疼痛等慢性疼痛［1-2］。該種痛性神經(jīng)病變經(jīng)常是患者化療終止或者化療藥物劑量減少的重要原因，嚴重影響腫瘤患者的治療［3-4］。由于泰素誘導慢性疼痛的機制并不清楚，目前并無有效的防治手段。炎癥反應可促進細胞因子或趨化因子表達上調(diào)，并參與多種生理、病理過程［5］。趨化因子CCL2 也稱單核細胞趨化蛋白，通過募集巨噬細胞或者小膠質(zhì)細胞，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病［6］。此外，同行的研究顯示：趨化因子CCL2也參與了神經(jīng)損傷誘導的痛覺過敏［7］，抑制CCL2上調(diào)顯著緩解神經(jīng)損傷誘導的慢性疼痛［8］。然而，目前并不清楚背根神經(jīng)節(jié)CCL2 是否參與泰素誘導的慢性疼痛，且其上調(diào)機制也無文獻報道。本研究擬觀察連續(xù)腹腔注射泰素后，背根神經(jīng)節(jié)CCL2 和轉(zhuǎn)錄因子STAT3 表達變化，同時觀察抑制CCL2 或STAT3 功能后，機械性慢性疼痛的變化；最后明確STAT3 是介導CCL2 上調(diào)的上游分子。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

SPF 級成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量220～280 g，桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供。于12 h 光照-黑暗循環(huán)、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食。室溫（22.0±0.5）℃，濕度（55±10）%。所有實驗操作均按照桂林醫(yī)學院實驗動物中心倫理要求和使用原則進行。大鼠隨機分成6 組，6 組動物的平均體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義，包括：溶劑對照組24 只、泰素組18 只、鞘內(nèi)注射CCL2 中和性抗體+泰素組6 只、鞘內(nèi)注射S3I-201+泰素組6 只、泰素+溶劑組6 只、鞘內(nèi)注射C188-9+泰素組6 只。

1.2 鞘內(nèi)注射

參照同行的方法［9］，異氟烷麻醉后，俯臥大鼠，以微量注射器從L4-L5 椎間隙緩慢進針，大鼠尾巴突然出現(xiàn)顫動或甩動，表示成功穿入鞘內(nèi)，保持穿刺針位置不變將溶劑或藥物緩慢注入。

1.3 行為學測試

利用Von Frey 纖毛評估動物的50%后爪撤足閾值。初次測試前，大鼠在測試籠中連續(xù)適應3 d，每天2 h。給藥后進行測試，應用不同強度的von Frey 纖維絲通過箱底金屬網(wǎng)孔對大鼠足底部皮膚施加機械性刺激，von Frey 纖維絲垂直，微彎，在大鼠足心部停留6～8 s。以2.041 g 刺激強度為初始刺激強度。如果撤足反應為陰性，則再選用刺激強度呈對數(shù)遞增的相鄰von Frey 纖維絲繼續(xù)刺激。如果大鼠出現(xiàn)快速的撤足反應或舔足反應，表示撤足反應為陽性，則再選擇相鄰遞減的刺激強度給予刺激，并記錄刺激的強度。從出現(xiàn)陽性反應的前一次開始，共測6 次。每次檢測間隔至少5 s，記錄測量值（表），采用“up-down”的方法計算得出50%撤足閾值（50%withdrawal threshold）：

公式中Xf=最末次測試強度的對數(shù)值，κ值根據(jù)撤足反應模式查表得出，δ=von frey 纖維筆之間對數(shù)差值的均值。50%撤足閾值數(shù)值大小直接反映大鼠機械性痛閾的高低。

1.4 免疫組織熒光實驗

分別于不同時間點腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）深度麻醉，迅速主動脈插管，快速灌注4 ℃生理鹽水250 mL，后用4 ℃多聚甲醛溶液（40 g/L）400 mL 灌注固定。取L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)置于預冷的多聚甲醛溶液后固定3 h。30%蔗糖溶液脫水3 d。冰凍切片，厚度15 μm，PBS 清洗切片3 次，每次5 min。室溫下，驢血清封閉1 h 后加入一抗：抗CCL2抗體（1∶200，Santa Cruz）、抗GFAP抗體（1∶500，Chemicon）、抗NF-200 抗體（1∶500，Chemicon）、抗IB4 抗體（1∶500，Chemicon）以及抗STAT3 抗體（1∶500，abcam），4 ℃孵育過夜。后用PBS 洗滌3 次，加入相應的青色熒光染料（Cy3）標記和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的IgG（1∶200，Jackson Immuno Research），于室溫下避光孵育1 h，PBS 清洗3 次。萊卡顯微鏡（Leica，Germany）下觀察并拍照。

1.5 Western blot 實驗

在不同時間點，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉下，迅速取L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)，按照每100 mg 組織加入1 mL 蛋白裂解液，低溫勻漿，超聲破碎，4 ℃16 000 ×g離心30 min，取上清液。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，后吸取等量樣品加入上樣緩沖液煮沸10 min。SDS 凝膠電泳分離目的蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，孵育CCL2、STAT3 或β-actin 一抗。次日TBST 緩沖液清洗3 次，后用羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h。TBST 清洗2 次后，滴加ECL 溶液，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)LAS-400（GE 公司，美國）曝光。使用Image J 軟件分析圖像結(jié)果。

表1 被檢查的mRNA 引物序列Table 1 Specific Primer Sequences used for PCR

1.6 RT-qPCR 檢測

在不同時間點，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉下，迅速取L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)。使用Trizol 溶液抽提總RNA。按照PCR 產(chǎn)品試劑盒的操作說明進行實驗。表1顯示PCR引物序列。反應程序如下：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；60 ℃，20 s，40 個循環(huán)。將所得Ct 值按2-ΔΔCT方法進行數(shù)據(jù)處理。

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示。正態(tài)性檢驗采用Shapiro-wilk 方法進行，P＞0.1 表示數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的多組計量數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析，對方差齊的數(shù)據(jù)，兩兩比較時采用Tukey′s 法進行校正；當方差不齊時，兩兩比較時采用Dunnett′s T3 法進行校正。采用Person 相關分析CCL2 蛋白表達量和STAT3 蛋白表達量之間的關系。多時間點重復測量的數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析進行比較。以α=0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔注射泰素上調(diào)背根神經(jīng)節(jié)CCL2 表達

相對于生理鹽水組，連續(xù)腹腔注射泰素顯著誘導機械性痛覺過敏（圖1A），重復測量方差分析結(jié)果表明，相較于腹腔注射生理鹽水的大鼠，注射泰素的大鼠機械痛閾較低，差異具有統(tǒng)計學意義（F=199.44，P＜0.001），而且機械痛閾差異隨時間變化而變化（F=7.04，P＜0.001；表2）。Western blot 結(jié)果顯示：經(jīng)方差分析，4 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=19.22，P＜0.001）；進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)Vehicle 組與注射泰素第1 天比較CCL2 蛋白無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.666），而與注射泰素第4 天（P=0.025）和第10 天（P=0.009）比較CCL2 蛋白顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，提示與生理鹽水組相比，注射泰素后第4 天，背根神經(jīng)節(jié)CCL2 蛋白表達顯著上調(diào)，并維持到第10 天（實驗結(jié)束；圖1B）。RT-qPCR 檢測顯示：經(jīng)方差分析，4 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=27.04，P＜0.001）；進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)Vehicle 組與注射泰素第1 天比較CCL2 蛋白無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.720），而與注射泰素第4 天（P＜0.001）和第10 天（P＜0.001）比較CCL2 mRNA 均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，提示首次注射泰素后第4 天和第10 天，CCL2 mRNA表達也顯著上調(diào)（圖1C）。以上結(jié)果提示，泰素誘導的CCL2 蛋白上調(diào)可能源于靶基因的轉(zhuǎn)錄增強。

表2 PTX 誘導痛覺過敏Table 2 Injection of paclitaxel（PTX）induced mechanical allodynia （±s）

表2 PTX 誘導痛覺過敏Table 2 Injection of paclitaxel（PTX）induced mechanical allodynia （±s）

圖1 腹腔注射泰素增加背根神經(jīng)節(jié)CCL2 的表達Fig.1 Paclitaxel application increases the expression of CCL2 in DRG

2.2 表達于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元CCL2 介導泰素誘導的慢性機械性痛覺過敏

免疫組織熒光結(jié)果進一步顯示：首次泰素注射后第10 天，背根神經(jīng)節(jié)CCL2 的熒光強度顯著高于對照組（圖2A），且CCL2 主要與NF200 陽性的大神經(jīng)元和IB4 陽性的小神經(jīng)元共染，與GFAP陽性的膠質(zhì)細胞不存在共染（圖2B）。重要的是，行為學結(jié)果顯示：預先注射CCL2 中和性抗體，顯著緩解泰素誘導的機械性痛覺過敏，重復測量方差分析結(jié)果表明，注射不同藥物的大鼠機械痛閾差異具有統(tǒng)計學意義（F=50.69，P＜0.001），而且機械痛閾差異隨時間變化而變化（F=3.94，P＜0.001）。組間比較結(jié)果顯示：腹腔注射生理鹽水的大鼠機械痛閾高于注射泰素的大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；鞘內(nèi)注射CCL2 中和性抗體的大鼠機械痛閾高于注射對照抗體的大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；表3，圖2C）。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子STAT3 上調(diào)介導泰素誘導機械性痛覺過敏

研究顯示：轉(zhuǎn)錄因子STAT3可通過調(diào)節(jié)細胞因子的表達，從而參與神經(jīng)免疫疾病［10］。我們檢測了STAT3 的表達。免疫印跡結(jié)果顯示：經(jīng)方差分析，四組間差異有統(tǒng)計學意義（F=32.59，P＜0.001）；進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)應用泰素的第1 天與Vehicle 組相比，STAT3 蛋白表達量無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.626），而應用泰素的第4天（P＜0.001）和10 天（P＜0.001），與Vehicle 組相比STAT3 蛋白的表達顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（圖3A）。免疫組織熒光實驗進一步證實：腹腔注射泰素顯著上調(diào)STAT3 表達（圖3B），且上調(diào)的STAT3 表達在NF200 陽性的大神經(jīng)元和IB4 陽性的小神經(jīng)元共染（圖3C）。此外，行為學結(jié)果顯示：注射STAT3 的抑制劑S3I-201，顯著緩解泰素誘導的機械性痛覺過敏，重復測量方差分析結(jié)果表明，注射不同藥物的大鼠機械痛閾差異具有統(tǒng)計學意義（F=36.03，P＜0.001），而且機械痛閾差異隨時間變化而變化（F=3.12，P=0.005）。組間比較結(jié)果顯示：腹腔注射生理鹽水的大鼠機械痛閾高于注射泰素的大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；鞘內(nèi)注射CCL2 中和性抗體的大鼠機械痛閾高于注射對照抗體的大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003；表4，圖3D）。此外，鞘內(nèi)注射另一種STAT3 的抑制劑C188-9 后也顯著緩解泰素誘導的痛覺過敏。重復測量方差分析結(jié)果表明，注射不同藥物的大鼠機械痛閾差異具有統(tǒng)計學意義（F=44.83，P＜0.001）。組間比較結(jié)果顯示：腹腔注射生理鹽水的大鼠機械痛閾高于注射泰素的大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；鞘內(nèi)注射CCL2 中和性抗體的大鼠機械痛閾高于注射對照抗體的大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001；表5，圖3E）。以上結(jié)果表明，背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元表達的STAT3 參與泰素誘導的慢性疼痛。

表3 CCL2 的中和性抗體緩解PTX 誘導痛覺過敏Table 3 Application of CCL2 neutralizing antibody attenuated the paclitaxel-induced mechanical allodynia （±s，g）

表3 CCL2 的中和性抗體緩解PTX 誘導痛覺過敏Table 3 Application of CCL2 neutralizing antibody attenuated the paclitaxel-induced mechanical allodynia （±s，g）

PTX：paclitaxel

圖2 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元CCL2 的上調(diào)介導泰素誘導慢性疼痛Fig.2 Enhanced CCL2 expression in DRG neurons contributing to the paclitaxel-induced mechanical allodynia

2.4 STAT3 介導泰素誘導的CCL2 上調(diào)

為了確定是否STAT3 介導泰素誘導的CCL2上調(diào)，我們首先執(zhí)行了雙熒光實驗。結(jié)果顯示：在背根神經(jīng)節(jié)中，STAT3 表達在CCL2 陽性細胞中，兩者表現(xiàn)出明顯的共定位（圖4A）。將CCL2 和STAT3 蛋白表達情況采用Pearson 相關性分析，其表達呈正相關，差異具有統(tǒng)計學意義（r=0.98，P＜0.001；圖4B）。重要的是，鞘內(nèi)注射STAT3 抑制劑S3I-201 顯著抑制泰素誘導的CCL2 蛋白上調(diào)（圖4C），免疫印跡結(jié)果經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=43.97，P＜0.001）；進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)PTX 組與Vehicle 組相比，CCL2蛋白明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），PTX+S3I-201 組與PTX 組相比，CCL2 蛋白明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。同時，S3I-201 也顯著抑制CCL2 mRNA 表達（圖4D），RT-qPCR 結(jié)果經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=42.04，P＜0.001）；進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)PTX 組與Vehicle 組相比，CCL2 mRNA 明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），PTX+S3I-201組與PTX 組相比，CCL2 mRNA 明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。此外，鞘內(nèi)注射另一種STAT3 的抑制劑C188-9，也能夠顯著抑制CCL2 mRNA 的表達（圖4E），RT-qPCR 結(jié)果經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=14.59，P＜0.001）；進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)PTX 組與Vehicle 組相比，CCL2 mRNA 明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），PTX+C188-9 組與PTX 組相比，CCL2 mRNA 明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。

表4 S3I-201 緩解PTX 誘導痛覺過敏Table 4 Application of S3I-201 attenuated the paclitaxel-induced mechanical allodynia （±s，g）

表4 S3I-201 緩解PTX 誘導痛覺過敏Table 4 Application of S3I-201 attenuated the paclitaxel-induced mechanical allodynia （±s，g）

PTX：paclitaxel

表5 C188-9 緩解PTX 誘導痛覺過敏Table 5 Application of C188-9 attenuated the paclitaxel-induced mechanical allodynia （±s，g）

表5 C188-9 緩解PTX 誘導痛覺過敏Table 5 Application of C188-9 attenuated the paclitaxel-induced mechanical allodynia （±s，g）

PTX：paclitaxel

3 討論

研究已顯示：神經(jīng)炎癥反應參與化療藥誘導的痛覺過敏［11］。本研究發(fā)現(xiàn)：泰素顯著上調(diào)背根神經(jīng)節(jié)CCL2 蛋白和mRNA 的表達，鞘內(nèi)注射CCL2 中和性抗體緩解泰素誘導的機械性痛覺過敏。此外，泰素也增加了STAT3 的表達，且CCL2和STAT3 共表達在背根神經(jīng)節(jié)相同神經(jīng)元中。預先應用STAT3 抑制劑S3I-201 緩解慢性疼痛，同時阻斷泰素誘導的CCL2 蛋白和mRNA 的上調(diào)。這些結(jié)果表明：轉(zhuǎn)錄因子STAT3 通過上調(diào)背根神經(jīng)節(jié)CCL2 表達，介導化療藥泰素誘導的慢性疼痛。

圖3 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元STAT3 上調(diào)參與泰素誘導痛覺過敏Fig.3 Upregulation of CCL2 expression involved in paclitaxel-induced allodynia in DRG neurons

CCL2，作為一個可以被神經(jīng)元合成并釋放的趨化因子，已被證實在幾種病理性疼痛模型中介導疼痛反應［12］。此外，報道顯示：脊髓背角CCL2/CCR2 信號通路參與紫杉醇誘導的痛性神經(jīng)病變［13］。目前的研究顯示：泰素處理顯著增加背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元CCL2 的表達，且鞘內(nèi)注射CCL2 中和性抗體緩解泰素誘導的機械性痛覺過敏。這些結(jié)果表明：外周和中樞CCL2 均可能參與化療藥泰素誘導的痛性神經(jīng)病變。研究也顯示：CCL2 顯著增加背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的興奮性突觸后電流的頻率［14］，因此，泰素誘導上調(diào)的CCL2 可能通過提高背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的活性［15］，從而介導慢性疼痛。值得注意的是，我們也發(fā)現(xiàn)：阻斷CCL2 信號通路并沒有完全緩解泰素誘導的痛覺過敏，提示其他的分子機制可能也涉及泰素誘導的痛性神經(jīng)病變。

圖4 STAT3 介導泰素誘導的CCL2 上調(diào)Fig.4 STAT3-mediated upregulation of CCL2 expression following paclitaxel application

信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，最初被認為介導炎癥和免疫反應，現(xiàn)在被認為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)變性、突觸可塑性和記憶形成中起著關鍵作用［10］。研究顯示：STAT3 參與神經(jīng)病理性疼痛的誘導和維持。例如，脊神經(jīng)損傷顯著激活脊髓星形膠質(zhì)細胞中STAT3［16］，且抑制STAT3 激活緩解神經(jīng)損傷誘導的痛覺過敏［17-18］。目前的研究發(fā)現(xiàn)：化療藥泰素的應用顯著上調(diào)背根神經(jīng)節(jié)STAT3 的表達，且鞘內(nèi)注射STAT3 抑制劑S3I-201 顯著緩解泰素誘導的痛覺過敏。已有研究顯示：STAT3 可通過調(diào)節(jié)脊髓背角趨化因子CXCL12 的表達介導長春新堿誘導的痛覺過敏［19］。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，STAT3 與CCL2 共表達在背根神經(jīng)節(jié)同一神經(jīng)元中，且鞘內(nèi)注射STAT3 抑制劑阻斷泰素誘導的CCL2 表達上調(diào)。總之，這些結(jié)果提示，背根神經(jīng)節(jié)STAT3 通過介導趨化因子CCL 上調(diào)在化療藥泰素誘導的痛覺過敏中起重要作用。