張鈺明，向 興，王學貴

(四川農業(yè)大學 農學院/國家級作物學教學實驗示范中心，四川 成都 611130)

褐飛虱Nilaparvata lugens 屬同翅目Homoptera飛虱科Delphacidae，食性專一，只危害水稻、野生稻等稻類[1]，具有遷飛性、發(fā)生量大、種群增長迅速、易暴發(fā)成災、持續(xù)時間長、防治難度大等特點。常見的褐飛虱防治方法包括化學防治和生物防治，其中高效廣譜的化學防治占據(jù)主要地位，但農藥對害蟲的天敵也同樣存在致死作用。此外，長期、大量、不合理的農藥使用已使褐飛虱對化學殺蟲劑產生了廣譜抗藥性[2]。根據(jù)近幾年來的抗性監(jiān)測結果[3]，褐飛虱已對有機磷、有機氯、氨基甲酸酯類、煙堿類、苯基吡唑類及新煙堿類等多種類型的殺蟲劑產生了不同程度的抗性，且抗藥性發(fā)展迅速。目前已知的稻飛虱對各類殺蟲劑的抗性機制包括水解酶(酯酶)、谷胱甘肽、細胞色素P450s 等解毒代謝酶活性提高，乙酰膽堿酯酶等靶標部位敏感度降低等[4-5]。因此，為延緩褐飛虱抗藥性的發(fā)展，可選擇無交互抗性的防控藥劑和在殺蟲劑中添加增效劑[6]。

噻蟲嗪是一種廣譜的新煙堿類殺蟲劑，能有效防治同翅目、鱗翅目、鞘翅目和纓翅目害蟲，且對同翅目害蟲有特效[7]。從1991 年起，噻蟲嗪被廣泛運用于亞洲各稻區(qū)稻飛虱的防控。近年來，稻飛虱對噻蟲嗪的田間抗性在抗性強度和地理分布上呈現(xiàn)出極大的增強趨勢，肖漢祥等[8]發(fā)現(xiàn)廣東田間褐飛虱種群對噻蟲嗪已達高水平抗藥性(61.0～517.8倍)。但因防治成本較低和對褐飛虱仍具有較好的防效，且褐飛虱抗噻蟲嗪種群尚未對其他殺蟲劑表現(xiàn)出明顯的交互抗性，噻蟲嗪仍為防控褐飛虱的重要藥劑品種之一。為了解噻蟲嗪對褐飛虱的解毒代謝酶活性的影響，本研究采用稻苗浸漬法，對四川農業(yè)大學水稻所溫室褐飛虱種群和敏感種群進行增效劑試驗及酶活性測定，以期為褐飛虱的抗性治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

褐飛虱室內敏感品系由華中農業(yè)大學李建洪教授課題組于2017 年提供，褐飛虱田間種群2017年采集于四川農業(yè)大學水稻所溫室。試驗用水稻為感蟲品種TN1。

實驗室飼養(yǎng)溫度為(27±1)℃，相對濕度為70%±10%，光周期為14 h光∶10 h 暗。

1.2 試驗藥劑和試劑

φ 為98% 吡蟲啉原藥(江蘇威耳化工有限公司)；φ 為98% 噻蟲嗪原藥(河北德瑞化工有限公司)；φ 為98%噻嗪酮原藥(山東華陽農藥化工集團有限公司)；φ 為98%毒死蜱原藥(湖北沙隆達股份有限公司)；φ 為10%三氟苯嘧啶乳油(美國杜邦公司)；φ 為95.9% 氟啶蟲胺腈原藥(美國陶氏益農公司)。

胡椒基丁醚(PBO)、馬來酸二乙酯(DEM)、磷酸三苯酯(TPP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇(DTT)、苯基硫脲(PTU)、α-苯基磺酰氟(PMSF)、考馬斯亮藍G250、牛血清蛋白、還原型輔酶II 鈉鹽(NADPH)、2，4-二硝基氯苯(CDNB)、還原型谷胱甘肽(GSH)、α-乙酸萘酯(α-Na)、顯色固藍BB 鹽、對硝基苯酚、對硝基苯甲醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、毒扁豆堿、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-乙酸奈酯(β-NA)，均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 毒力測定 采用稻苗浸漬法進行毒力測定，方法參照文獻[9-10]。將殺蟲劑原藥用丙酮溶解作為母液，然后用0.1% (φ)Triton X-100 水溶液將母液稀釋成5 個濃度梯度的藥液；選取室內培養(yǎng)的TN1 水稻幼苗，每組15 株，在陰涼處干燥至表面無水痕，將稻苗按藥液質量濃度由低到高的順序浸泡30 s，以0.1% (φ) Triton X-100 水溶液為對照組；取出后晾干30 min 至稻莖上無明水，以浸濕的脫脂棉包住稻株根部放入培養(yǎng)杯中；挑取齡期一致的3 齡若蟲放入培養(yǎng)杯中，每杯15 頭，剔除機械死傷供試蟲，每處理重復3 次，處理96 h 后檢查死亡蟲數(shù)。采用SAS 軟件計算褐飛虱抗性種群及敏感種群3 齡若蟲對2 種新型殺蟲劑的毒力。常規(guī)藥劑抗性倍數(shù)參照文獻[11]中所提出的褐飛虱敏感基線計算，對2 種新型殺蟲劑的抗性倍數(shù)(Resistance ratio，RR)參照褐飛虱室內敏感品系毒力測定結果計算得出。

RR=田間種群LC50/敏感品系LC50。

抗性水平分級標準為：敏感(RR≤5.0)；低水平抗性(5.0＜RR≤10.0)；中等水平抗性(10.0＜RR≤100.0)；高水平抗性(RR＞100.0)。

1.3.2 增效劑測定 參照文獻[10]的方法，采用稻苗浸漬法。首先用DEM 200 μg/mL、PBO 20 μg/mL 和TPP 80 μg/mL 與噻蟲嗪復配后處理稻苗。取生長一致的褐飛虱3 齡若蟲置于處理后的稻苗上，每杯15 頭試蟲，每個處理3 次重復，以單獨使用殺蟲劑處理為對照組。根據(jù)1.3.1 確定的調查時間，統(tǒng)計各處理的死亡蟲數(shù)，并按照公式計算增效倍數(shù)或增效系數(shù)(Synergism ratio，SR)。

SR=單劑對試蟲的LC50/單劑+增效劑對試蟲的LC50。

1.3.3 解毒代謝酶活性的測定 羧酸酯酶測定參照Wang 等[12]的方法。取不同處理的褐飛虱成蟲各20 頭，加入1 mL 預先冷卻的0.04 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中，將混合物在冰浴下充分勻漿，10 400 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液作為粗酶，冰浴備用。在每個試管中依次加入450 μL 磷酸緩沖液、1.8 mL 3×10-4mol/L 的α-NA 溶液(含有3×10-4mol/ L 毒扁豆堿)和50 μL 稀釋后的酶液?；靹蚝笥?0 ℃恒溫水浴中反應15 min，然后立即加入900 μL 顯色液(ρ 為1%的固藍BB 鹽溶液和ρ 為5% SDS 溶液體積比為2∶5，現(xiàn)配現(xiàn)用)，終止反應后再向對照組溶液中加入酶液50 μL，搖勻后靜置2 min，于600 nm(α-NA)/555 nm(β-NA)下測吸光度。試驗各處理設3 次重復，每次重復平行測定3 次。按照公式計算羧酸酯酶的活性。

谷胱甘肽S-轉移酶活性測定參照Wang 等[12]的方法。加入預冷的0.1 mol/L、pH 6.5 的磷酸鹽緩沖液[含1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)]，將混合物在冰浴下充分勻漿，10 400 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液作為粗酶，冰浴備用。以2，4-二硝基氯苯(CDNB)為底物，在酶催化下形成谷胱甘肽S-芳基復合體，在340 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰。比色皿中依次加入790 μL 0.1 mol/L pH 6.5 磷酸緩沖液、30 μL 15 mmol/L CDNB、50 μL 粗酶液和30 μL 30 mmol/L GSH(還原型谷胱甘肽)，反應總體積為0.9 mL，迅速混勻后，在340 nm 下用時間驅動程序監(jiān)測其吸光度在2 min內的變化，計算反應速度。每個處理設3 次重復，每重復平行測定3 次。按照公式計算谷胱甘肽S-轉移酶的活性。

細胞色素P450s 酶活性測定參照Rose 等[13]的方法。取不同處理的褐飛虱成蟲各40 頭，加2 mL預冷的磷酸鹽緩沖液[0.11 mol/L，pH 7.6，含0.11 mmol/L DTT、0.11 mmol/L EDTA、0.11 mmol/L PMSF、0.11 mmol/L PTU 和20% (φ)甘油]冰上勻漿，勻漿液于4 ℃10 000 r/min 離心10 min，取上清液為酶液低溫儲存?zhèn)溆?；在酶標板中加?00 μL 對硝基苯甲醚(2×10-3mol/L)和90 μL 酶液，27 ℃條件下振蕩溫育3 min，再加入10 μL NADPH(9.6×10-3mol/L)開始反應，測定D405 nm，每20 s 讀取數(shù)據(jù)1 次，持續(xù)2 min，根據(jù)公式計算細胞色素P450s酶活性。

2 結果與分析

2.1 褐飛虱的解毒酶對噻蟲嗪抗性的影響

結果(圖1)表明，溫室種群的P450s 酶比活力最高，4.70×10-3IU/mg，是敏感種群的2.13 倍，而經PBO處理后P450s 活性被明顯著抑制，僅為1.25×10-3IU/mg(圖1C)。室內敏感品系和溫室抗性種群經TPP 和DEM 處理后，其羧酸酯酶(圖1A)和谷胱甘肽S-轉移酶(圖1B)活性變化不大。因此，P450s 活性增強對褐飛虱溫室種群的抗藥性形成起著較為重要的作用。

圖 1 不同增效劑處理下褐飛虱的解毒代謝酶活力Fig. 1 Detoxification enzyme activities of Nilaparvata lugens under different synergists

2.2 褐飛虱種群的毒力測定

結果(表1)表明，溫室種群對新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮均達到高抗水平，分別為1 902.55、277.92 和856.06 倍；對毒死蜱的抗性為低水平，為9.65 倍，對三氟苯嘧啶及氟啶蟲胺腈都表現(xiàn)為敏感。三氟苯嘧啶與吡蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮無交互抗性(敏感品系和溫室種群的毒力LC50的95%置信區(qū)間有重疊，差異不顯著)，與氟啶蟲胺腈則表現(xiàn)出交互抗性(敏感種群和溫室種群的毒力LC50的95%置信區(qū)間無重疊，差異顯著)。

2.3 增效劑作用測定

結果(表2)表明，增效劑DEM、PBO 和TPP 作用于敏感品系對噻蟲嗪的增效倍數(shù)分別為1.07、1.14 和1.04 倍，對溫室種群的增效倍數(shù)分別為1.40、1.99 和1.28 倍，因此PBO 作用于溫室種群對噻蟲嗪的增效最明顯。

表 1 6 種殺蟲劑對褐飛虱的毒力Table 1 The toxicities of six insecticides on Nilaparvata lugens

表 2 3 種增效劑對噻蟲嗪的增效作用Table 2 Synergistic effects of three synergists on thiamethoxam

3 結論與討論

近年來已有大量關于褐飛虱對各類殺蟲劑產生抗藥性的報道，Zhang 等[14]采用稻莖浸漬法測定了8 個褐飛虱稻田種群的抗藥性，結果表明種群對吡蟲啉和噻嗪酮均表現(xiàn)為高水平抗性，抗性倍數(shù)分別為233.3～2 029.0 和147.0～1 222.0 倍，對噻蟲嗪為中、高水平抗性(25.9～159.2 倍)，對毒死蜱仍處于低、中等水平抗性(7.4～30.7 倍)。本研究結果表明，吡蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮對溫室褐飛虱種群均達到高抗水平，對毒死蜱仍處于低水平抗性，與肖漢祥等[8]對田間褐飛虱種群的抗性監(jiān)測結果較為接近，但新型防控藥劑氟啶蟲胺腈與三氟苯嘧啶均表現(xiàn)敏感。因此，新型防控藥劑氟啶蟲胺腈和三氟苯嘧啶輪換使用，可有效防控褐飛虱的發(fā)生。

昆蟲對農藥產生抗藥性主要體現(xiàn)在殺蟲劑作用靶標敏感性降低以及昆蟲解毒酶代謝能力增強2 個方面[15]。范銀君等[16]研究發(fā)現(xiàn)細胞色素P450s 在昆蟲對新煙堿類殺蟲劑的抗藥性中起主要作用。莊安祥[17]通過qRT- PCR 測定了吡蟲啉LD50劑量處理對褐飛虱P450s 基因表達量的影響，認為褐飛虱抗新煙堿類殺蟲劑主要與P450s 活性增強有關，其次與乙酰膽堿酯酶的敏感度降低有關。張平艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，室內選育建立的桃蚜Myzus persicae 抗噻蟲嗪種群的羧酸酯酶及多功能氧化酶(MFO)O-脫甲基的比活力分別是敏感品系的6.12 和2.03 倍。Gao等[19]采用PBO 和TPP 處理抗噻蟲嗪的西花薊馬Frankliniella occidentalis 種群后，對噻蟲嗪有很高的增效作用，DEM 對噻蟲嗪沒有協(xié)同作用，說明西花薊馬對噻蟲嗪的抗藥性主要與羧酸酯酶以及細胞色素P450s 酶活性增強有關。本研究通過對褐飛虱增效劑及3 種解毒代謝酶活力測定發(fā)現(xiàn)，PBO 表現(xiàn)出明顯的增效作用和對細胞色素P450s 活性顯著的抑制作用，說明細胞色素P450s 酶參與了褐飛虱對噻蟲嗪的抗藥性機理，該結果與毛旭連[20]就灰飛虱Laodelphax striatellus 對噻蟲嗪及噻嗪酮抗藥性機理作出的研究結果相近。Sun 等[21]研究表明，P450s 基因CYP6ER1 參與了褐飛虱對噻蟲嗪的解毒代謝，但是也發(fā)現(xiàn)有另外6 個未明確作用的調控P450s 的基因(CYP408A1V2、CYP427A1、CYP6CS1、CYP4C76、CYP4DD1 和CYP417A1V2) 高度表達。Pang 等[22]的研究表明CYP6ER1 基因也涉及褐飛虱對吡蟲啉的抗藥性機理，此外Zhang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)有其他的P450s 基因，如CYP6AY1、CYP4CE1、CYP6CW1 等也參與褐飛虱對吡蟲啉的抗藥性發(fā)展。以上研究說明細胞色素P450s 在褐飛虱對新煙堿類殺蟲劑抗藥性機理中的作用值得進一步研究。

本試驗采用稻苗浸漬法，通過對褐飛虱敏感品系和溫室種群的毒力及酶活性測定，初步明確了褐飛虱對噻蟲嗪的代謝抗藥性主要受細胞色素P450s活性增強影響，使用該殺蟲劑時可添加增效劑PBO 從而抑制P450s 酶活性。由于本研究僅在生物化學水平初步探究了噻蟲嗪對褐飛虱的毒力及解毒代謝酶活性的影響，其抗藥性是否與靶標突變及體壁穿透下降等有關還需進行深入研究。