鐘明葉，劉學彬，王久明，周子寒，陳 帥，羅愛民

(1.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065；2.四川茂華食品有限公司，四川眉山 620010；3.四川宜府春酒廠有限責任公司，四川邛崍 611530)

紅曲黃酒作為中國三大典型黃酒之一，是以糯米為主要原料，添加紅曲、藥白曲和酵母等，經多種微生物糖化發(fā)酵釀造而成[1]。由于紅曲中的紅曲霉菌代謝產生Monacolin K、紅曲色素和γ-氨基丁酸等具有顯著降血壓、降血脂和降膽固醇的代謝物[2-4]，因此將紅曲添加至黃酒中進行發(fā)酵，賦予黃酒以與眾不同的功效，提高了其經濟價值和保健價值[5-6]。紅曲黃酒的風味是影響紅曲黃酒的感官品質與風格的一個關鍵因素，特別是其中含量微少的特征性揮發(fā)性風味物質，它們的存在對紅曲黃酒的風味形成有關鍵作用[7-8]。但是，就紅曲對黃酒發(fā)酵產品中風味物質的影響，目前還沒有明確研究。此外，當發(fā)酵培養(yǎng)基組成改變以后，紅曲的糖化力、液化力和酯化力等是否會發(fā)生較大改變也尚不清楚。

無機鹽可為微生物提供除碳、氮源以外的各種重要元素，在微生物的產氫過程中產生輔助的作用從而參與生理和生物化學反應[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e、Zn、Mg、Mn 和Cu等金屬離子對真菌的生長和次級代謝產物的產生具有促進作用[10-11]。也有研究表明，在土霉菌培養(yǎng)基中添加Fe、Zn、Mg、Mn和Cu等金屬可以有效的提高洛伐他汀的產量，對洛伐他汀生產過程中的水分、pH 值和總糖消耗以及Monacolin J轉化率都有較為顯著的影響[12-14]。

氣相色譜（GC）技術因其具有高靈敏性和優(yōu)越的分離性能的特點，被廣泛使用于醫(yī)學藥品、天然藥物、食品、化工等領域[15-21]。由于酒中的揮發(fā)性風味物質組成較為復雜，同時含量低且容易揮發(fā)，這就使得對酒中的揮發(fā)性風味物質的分析必須選用高效的現(xiàn)代分析儀器進行。近年來，GC 技術也廣泛的應用于酒類香氣物質的研究中[22-26]。本研究通過向紅曲中添加金屬離子篩選出糖化力和酯化力較高的品種應用于紅曲黃酒的釀造，運用GC 對得到的黃酒產品的風味物質進行定性和定量分析，比較添加紅曲后黃酒風味物質的變化以及分析不同發(fā)酵條件下的紅曲發(fā)酵產物對黃酒風味物質的影響。為紅曲黃酒釀造及提高紅曲黃酒風味物質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 實驗材料

紅曲霉（Monascus ruber），來自于四川大學輕紡與食品學院食品系生物實驗室保藏。

優(yōu)質粳糯米：孝感市富饒農副產品有限責任公司。

紅曲發(fā)酵產物：鋅離子紅曲，鎂離子紅曲，無金屬離子紅曲。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、酵母提取物0.4%、麥芽浸粉2%、瓊脂2%、KH2PO40.2%、NaNO30.2%、MgSO40.1%，121 ℃滅菌20 min[14]。

種子培養(yǎng)基：麥芽汁15 g/L，燕麥粉5 g/L，玉米粉5 g/L，葡萄糖10 g/L。

1.1.2 實驗試劑

濃硫酸、20%氫氧化鈉溶液、無水乙醇溶液等一般常用化學藥品均為國產分析純；乙酸正戊酯、2-乙基正丁酸、叔戊醇均為國產色譜純。

1.1.3 儀器設備

YXQ-LS-30SII 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海一恒實驗設備有限公司；FA2004B 電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；MJ-250 恒溫干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-ID 雙人單面超凈工作臺，江蘇凈化設備公司；FW-100 高速萬能粉碎機，天津杰斯特儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；7890A 自動進樣氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲種子液

在28 ℃下活化3 d 的斜面種子，用無菌水制成孢子數量控制在106個/mL（鏡檢）的孢子懸浮液。取2 mL 接種于種子培養(yǎng)基中，160 r/min，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 紅曲發(fā)酵產物

稱取50 g 大米加入250 mL 錐形瓶，經過60 ℃浸泡2 h 后分別加入FeSO4、MnSO4、ZnSO4、MgSO4，高溫滅菌蒸煮處理后，按照5%的比例接種搖瓶種子液，28 ℃下培養(yǎng)12 d 且第4 天開始定期添加一定水分保濕。第12 天，將4 種紅曲發(fā)酵物在38 ℃下烘干，然后粉碎過80目篩。

1.2.3 紅曲黃酒發(fā)酵

糯米浸泡在水中24 h，然后常壓下清蒸0.5 h，待米飯品溫降到30 ℃左右時，按米量0.4%加入安琪甜酒曲（根霉曲）與米飯拌勻、搭窩，于28 ℃保溫培養(yǎng)。同時稱取紅曲發(fā)酵產物，加其10 倍左右的水浸曲2 d，待糖化48 h 左右時，按照米量的1‰分別添加活化后的酵母菌及紅曲發(fā)酵產物，以料液比1∶1.8（m/v）加入滅菌后冷卻至30 ℃的溫開水，充分攪拌均勻，用蠟紙扎口于28 ℃生化培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵9 d，至米粒下沉。最后過濾壓榨。

1.2.4 不同紅曲對黃酒揮發(fā)性風味成分的影響

樣品預處理：將樣品置于4 ℃以10000 r/min 離心10 min 提取上清液，用0.22 μm 濾膜進行真空抽濾，得到待測樣品。采用毛細管氣相色譜(GC)法，氫火焰離子化檢測器檢測樣本，以標準品保留時間定性，叔戊醇、乙酸正戊醇和2-乙基丁酸作內標定量。

氣相色譜檢測內標液的濃度：15 mg/100 mL的2-乙基丁酸、16.5 mg/100 mL 的乙酸正戊酯和16 mg/100 mL叔戊醇。

GC 條件：毛細管柱為ZB-Waxplux，規(guī)格為60 m，0.25 mm，涂層厚0.25 μm；載氣使用氮氣，流速為1 mL/min，分流比20∶1；升溫程序：40 ℃，保持1 min，4 ℃/min 速度下升溫至150 ℃保持10 min，以10 ℃/min 速度升溫至210 ℃，保持18 min，以20 ℃/min 升溫至230 ℃，保持5 min；氫火焰離子化檢測器溫度為250 ℃。采用氣相色譜和內標法對黃酒揮發(fā)性成分進行定性和半定量分析。以2-乙基丁酸、乙酸正戊酯和叔戊醇為內標，根據Mo、FAN 所描述的方法對揮發(fā)性化合物進行了半定量測定，其公式如下[27]：

式中：C——分析物的相對濃度(mg/100 mL)；

Cis——樣品中內標(IS)的最終濃度；

Ac——分析物的峰面積；

Ais——內標的峰面積。

黃酒的樣品酒揮發(fā)性的香氣成分檢測用的是直接進樣法[28]。

1.2.5 數據處理

使用SIMCA-P 11.5 對黃酒香氣成分進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同紅曲對黃酒揮發(fā)性風味成分總體影響分析

在實驗前期根據對不同組分的紅曲發(fā)酵產物進行酯化力和糖化力的測定得到對照組以及添加鎂離子和鋅離子組的酯化力和糖化力較高，所以將這3組的紅曲產物應用于黃酒發(fā)酵。

在試驗中設定H0 組表示無紅曲的黃酒，H1 表示常規(guī)紅曲黃酒，H2 表示鋅離子紅曲黃酒，H3 表示鎂離子紅曲黃酒。通過對樣品進行離心過濾等前處理，得到待測樣品，進行氣相色譜法的定性和定量分析，黃酒揮發(fā)性風味成分種類和含量見表1。為能更直觀地分析出紅曲對黃酒揮發(fā)性風味成分的影響，將表1 中的香氣成分進行歸類比較，結果見圖1。

圖1 不同黃酒揮發(fā)性化合物的含量

4 種黃酒的揮發(fā)性風味成分鑒定結果表明，共有49 種揮發(fā)性風味成分，其中醇類13 種、酯類15種、酸類8 種、醛類7 種、酮類4 種、酚類及含氮物2種。其中有10 種是4 種黃酒共有的。由表2 可知，添加不同種類紅曲的黃酒和空白黃酒之間各種揮發(fā)性成分在含量和種類之間存在明顯不同，表明紅曲能顯著改變黃酒中的揮發(fā)性風味成分。

2.2 紅曲對黃酒揮發(fā)性風味成分的分類分析

2.2.1 紅曲對黃酒酯類揮發(fā)性風味成分的影響

酯類物質在酒中往往是一種很重要的呈香呈味成分。由表1 和圖2 可知，無紅曲組黃酒H0 和常規(guī)紅曲組黃酒H1 的酒樣中酯類總含量分別為3.64 mg/100 mL 和2.93 mg/100 mL，均低于金屬離子紅曲組黃酒，其中鋅離子紅曲組黃酒H2 為4.64 mg/100 mL，鎂離子組黃酒H3為4.71 mg/100 mL。添加紅曲的黃酒其酯類成分的種類明顯多于未添加紅曲黃酒。說明添加紅曲不僅增加了黃酒中酯類成分含量也增加了酯類成分的復雜性。

表1 不同黃酒中揮發(fā)性化合物分析

2.2.2 紅曲對黃酒醛類揮發(fā)性風味成分的影響

從表1 可知，無紅曲黃酒中的醛類物質總含量明顯高于紅曲黃酒，主要的醛類是乙醛和異丁醛，其中異丁醛含量為2.44 mg/100 mL，而紅曲黃酒中的主要醛類物質是乙醛，且紅曲黃酒中都不含異丁醛。同時無紅曲黃酒中的乙醛成分的含量遠遠高于金屬離子組黃酒。上述結果表明,添加紅曲能抑制黃酒中醛類物質的生成，且金屬離子紅曲能抑制黃酒中乙醛的產生。

2.2.3 紅曲對黃酒醇類揮發(fā)性風味成分的影響

醇類是一種重要的呈味物質，中國酒中重要的醇類物質主要有多元醇和高級醇。由表1 可以看出，就總醇含量而言，無紅曲組黃酒明顯高于紅曲組黃酒，但紅曲組黃酒尤其是金屬離子紅曲黃酒中的醇類物質種類相對豐富。上述結果表明，添加紅曲會在一定程度上降低黃酒中醇類物質的含量，不會使黃酒中的高級醇類物質含量過高，且能豐富黃酒中的醇類物質種類，從而也使得黃酒的整體風味更加醇厚豐滿。

2.2.4 紅曲對黃酒酮類揮發(fā)性風味成分的影響

由表1 可以發(fā)現(xiàn)，無紅曲組黃酒幾乎無酮類物質產生，而紅曲組黃酒中都檢測到了不同的酮類物質。對比4 組黃酒，可以發(fā)現(xiàn)其中無金屬離子組黃酒和鋅離子組都檢測到3 種酮類，而添加鎂離子組檢測到兩種酮類。其中無金屬離子紅曲組的酮類含量最高，為2.07 mg/100 mL。上述結果表明，紅曲的添加能促進黃酒中酮類物質的產生，金屬離子可能會影響紅曲發(fā)揮這一作用。

2.2.5 紅曲對黃酒酸類揮發(fā)性風味成分的影響

酸類在酒中往往起到協(xié)調、平衡的作用，可增加醇厚感、減少苦雜味。從表1 可以看出，4 種黃酒中共檢測出8種酸，其中低碳鏈飽和酸7 種，長鏈不飽和酸1種。在8種酸中，乙酸的含量最高，其中鎂離子紅曲黃酒的乙酸含量高達109.22 mg/100 mL。由表1 可以發(fā)現(xiàn)，添加紅曲后黃酒中的揮發(fā)性酸類物質總含量相對于未添加紅曲黃酒有極大的提高，上述結果表明，紅曲特別是金屬離子紅曲的添加可以豐富黃酒中揮發(fā)性酸類物質的種類和含量。

2.2.6 紅曲對黃酒酚類及含氮類揮發(fā)性風味成分的影響

酚類化合物可以在酒中起到呈香作用[29]，可以有效的抗衰老及預防眾多疾病的發(fā)生[30]。吡嗪類化合物是酒中的生物活性物質和重要香氣成分。從表1 中可知，4 種黃酒中共檢測出2 種酚類及含氮類揮發(fā)性物質，三甲基吡嗪和4-乙基苯酚。就酚類物質而言，4-乙基苯酚在無紅曲黃酒中的含量最高為2.38 mg/100 mL。以上結果說明，添加紅曲可能會促進黃酒中吡嗪類揮發(fā)性物質的生成，但卻會抑制酚類物質的生成。

2.2.7 不同紅曲黃酒的揮發(fā)性風味物質的主成分分析

圖2 不同黃酒揮發(fā)性香氣成分主成分分析得分載荷雙標圖

為探討揮發(fā)性風味物質與不同組分的黃酒之間的聯(lián)系，研究添加紅曲對黃酒揮發(fā)性風味成分的影響，利用SIMCA-P 11.5 軟件對4 組酒樣的揮發(fā)性風味物質的測量值進行主成分分析，香氣成分變量按表1 中次序依次編號得出不同黃酒及其揮發(fā)性香氣成分主成分分析得分載荷雙標圖。由圖2可以看出，不添加紅曲的黃酒（H0）與添加紅曲的黃酒(H1、H2、H3)分屬于不同的象限，添加普通紅曲的黃酒(H1)與添加金屬離子紅曲的黃酒(H2、H3)也分屬于不同的象限，這表明H0、H1、與H2、H3 在主成分上能分開，黃酒的香氣成分存在明顯差異。且由圖2 可知，甲醇（a1）、苯丙酸乙酯（b12）、乙酸（c1）、與主成分1 高度正相關，庚酸（c6）、癸酸（c7）、異丁酸（c3）、4-乙基苯酚（o2）、異丁醛（f3）與主成分1 高度負相關。（d3）、正丙醇（a2）、庚醇（a9）、與主成分2 高度正相關，總酯（b16）、乙酸乙酯（b2）、乙酸己酯(b6)與主成分2高度負相關。

3 結論

采用氣相色譜(GC)技術，對4 種不同發(fā)酵黃酒樣品中的揮發(fā)性物質進行了分離和鑒定。結果表明，添加金屬離子紅曲發(fā)酵的黃酒其酯類、酸類、酮類物質種類及總含量均高于對照組和無金屬離子紅曲發(fā)酵的黃酒，醇類、醛類、酚類及含氮物質的種類均高于對照組，總含量低于對照組和無金屬離子紅曲發(fā)酵的黃酒，說明金屬離子紅曲增加了黃酒中主要呈香類揮發(fā)性物質的種類。

本研究鑒定了49 個揮發(fā)性物質。基于不同黃酒揮發(fā)性物質的主成分分析，添加不同紅曲發(fā)酵物的黃酒與空白組黃酒在揮發(fā)性成分上存在明顯差異，由此可以對4 種黃酒進行鑒別，在相同的檢測條件下，添加不同紅曲的黃酒和不添加紅曲的黃酒檢測出不同的揮發(fā)性物質。加金屬離子的紅曲培養(yǎng)物能有效提高黃酒中揮發(fā)性物質的種類，增加黃酒的醇厚感，促使黃酒酒體更加豐滿，促進黃酒生產向具有更加鮮明、更加富有表現(xiàn)力的品種特征的方向發(fā)展，這也是黃酒生產的穩(wěn)定發(fā)展趨勢。除了黃酒發(fā)酵工藝外，合適的釀酒微生物的選育也是影響黃酒風味的重要因素之一。紅曲一直是黃酒風味物質研究領域常用的菌種制劑，本文通過添加金屬離子對紅曲進行優(yōu)化用于黃酒發(fā)酵，結果表明，添加不同的紅曲發(fā)酵物對黃酒的風味物質有明顯的改善，但其中的作用機制仍有待后續(xù)研究。