張宜文，趙海波,吳 紅，馬 康

(1.北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，北京 100021；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013)

隨著我國(guó)與世界各國(guó)食品領(lǐng)域貿(mào)易合作的不斷深化，食品安全成為各國(guó)監(jiān)管和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)基因生物的多樣化帶來(lái)了轉(zhuǎn)基因基質(zhì)的復(fù)雜性及其檢測(cè)的挑戰(zhàn)性[1]，全球農(nóng)業(yè)種植中涉及30多種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，其交易額逐年上升[2]。國(guó)際食品貿(mào)易中由于食品動(dòng)植物源成分摻雜或失信導(dǎo)致的損失每年高達(dá)400億美元[3-4]。全球范圍內(nèi)豐富的微生物種類(lèi)(細(xì)菌、病毒、支原體等)及構(gòu)型，以及感染宿主的多樣化讓檢測(cè)變得復(fù)雜化，從而突顯了非培養(yǎng)宿主式相對(duì)快速的檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)[5-6]。為降低生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷(xiāo)售、儲(chǔ)存等各環(huán)節(jié)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)和提高監(jiān)管效率，食品監(jiān)管部門(mén)對(duì)快速檢測(cè)方面的需求增強(qiáng)，使得聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在食品安全領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用與發(fā)展。

食品自身種類(lèi)的廣泛性、差異性和基體復(fù)雜性促使其檢測(cè)理論和方法不斷改進(jìn)和優(yōu)化。目前食品檢測(cè)領(lǐng)域的化學(xué)儀器技術(shù)包括色譜[7-8]、電化學(xué)[9]、光譜[10]、質(zhì)譜[11]、核磁[12]以及多種串聯(lián)技術(shù)[13]和生物傳感器[14]等(圖1)。這些方法廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域，在分離、鑒別、表征等方面有著顯著優(yōu)勢(shì)，但存在前處理步驟多、復(fù)雜食品基體回收率低和設(shè)備昂貴等問(wèn)題。食品檢測(cè)的生物技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫(ELISAs)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等技術(shù)，其中ELISAs是最常見(jiàn)的食品分析方法，但其對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境和樣品狀態(tài)的要求較高。PCR方法可以突破對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境以及食品基體的局限性，在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、動(dòng)植物源摻雜、微生物檢驗(yàn)方面可保持待測(cè)核酸分子的穩(wěn)定性，識(shí)別特異性好，靈敏度高，已得到了廣泛應(yīng)用。圖1中列出了食品分析技術(shù)的類(lèi)別以及相關(guān)類(lèi)別下的主流分析工具，圖中虛線所包含區(qū)域內(nèi)的儀器是相應(yīng)分析對(duì)象的主要使用儀器。

圖1 食品分析技術(shù)的類(lèi)別、分析工具以及分析對(duì)象Fig.1 Main analytical categories,techniques and objects in food analysisPCR:qPCR(熒光PCR),dPCR(數(shù)字PCR),PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)),LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)),HRM(高分辨熔解曲線分析技術(shù));ELISA:ICGT(膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)),RIA(放射免疫技術(shù)),FIA(熒光免疫技術(shù)),TRFIA(時(shí)間分辨熒光免疫分析),CLIA(化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)),SELEX(指數(shù)富集適配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)) ;LC/GC(液相/氣相色譜技術(shù));LC/GC/ICP MS(液相/氣相/電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù));PTR-MS(質(zhì)子轉(zhuǎn)移質(zhì)譜技術(shù));TIMS(熱電離質(zhì)譜技術(shù));DART-MS(實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜技術(shù));IR(紅外光譜分析技術(shù));Raman(拉曼光譜分析技術(shù));UV/FS(紫外可見(jiàn)/熒光光譜分析技術(shù))；AAS(原子吸收分光光譜分析技術(shù))；ICP(電感耦合等離子體光譜分析技術(shù))；XRF(X射線熒光光譜分析技術(shù));NMR(核磁波譜分析技術(shù))

1 PCR原理

PCR技術(shù)通過(guò)對(duì)核酸分子進(jìn)行變性、復(fù)性、延伸3個(gè)步驟的不斷循環(huán)，使目標(biāo)分子呈指數(shù)倍數(shù)的增長(zhǎng)，從而使微量、痕量的核酸達(dá)到可檢測(cè)水平。目前PCR技術(shù)主要可分為傳統(tǒng)PCR(cPCR)、熒光PCR(qPCR)和數(shù)字PCR(dPCR)三代，并在此基礎(chǔ)上建立了相關(guān)的食品檢測(cè)方法，三代PCR的工作原理如圖2所示。

圖2 3種PCR的工作原理Fig.2 Work flow of three polymerase chain reactorsA.cPCR ；B.qPCR；C.dPCR

cPCR分析儀通過(guò)控制反應(yīng)溫度，使待測(cè)核酸分子在不同溫度下變性、復(fù)性、延伸循環(huán)復(fù)制，再對(duì)經(jīng)多次復(fù)制后的核酸分子進(jìn)行凝膠分析，觀察是否出現(xiàn)目標(biāo)核酸的條帶；qPCR是在cPCR基礎(chǔ)之上，加入特定的熒光染料，其熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增后和染料結(jié)合的核酸分子的數(shù)量相關(guān)，通過(guò)終端PC可以實(shí)時(shí)顯示擴(kuò)增的狀態(tài)。對(duì)比擴(kuò)增后的熒光值與初始設(shè)定熒光強(qiáng)度，可得到待測(cè)核酸的閾值(Ct)，將Ct值代入到已知含量DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)核酸的 DNA分子含量[15]；dPCR技術(shù)是將qPCR體系等量均分到相互隔離的大數(shù)量(多數(shù)大于10 000個(gè))微小的反應(yīng)單元(芯片微孔或微滴液珠)中，且理想狀態(tài)下一個(gè)反應(yīng)體系中至多包含一個(gè)待測(cè)核酸分子。dPCR的反應(yīng)過(guò)程與qPCR相似，擴(kuò)增后的核酸分子在熒光下顯示熒光信號(hào)(表示為“1”)，或沒(méi)有熒光信號(hào)(表示為“0”)，通過(guò)泊松分布對(duì)熒光信號(hào)“0”和“1”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸含量的測(cè)定。dPCR不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，無(wú)需通過(guò)Ct值進(jìn)行濃度比較，被認(rèn)為是一種絕對(duì)定量的方法[16]。而且由于dPCR的反應(yīng)效率和精密度受食品基質(zhì)干擾的影響較小，理論上dPCR可以對(duì)所有可應(yīng)用于qPCR的檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行分析。

2 三代PCR相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展

自2003年以來(lái)，我國(guó)食品監(jiān)管相關(guān)部門(mén)分別針對(duì)動(dòng)物源、植物源、微生物和轉(zhuǎn)基因食品制定了相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法。本文統(tǒng)計(jì)了2003年至2019年6月現(xiàn)行有效的PCR相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并比較了cPCR、qPCR和dPCR相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)在檢測(cè)對(duì)象(表1)和實(shí)施年份、標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量(圖3)上的差異。

表1 食品中基于PCR分析的主要分析物比較Table 1 Comparison of major analytes in food based on PCR analysis

the relevant standards in this paper include the national,industrial and local standards related to PCR technology in food(本文涉及的“我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)”均包括食品中PCR技術(shù)相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn));FAO( Food and Agriculture Organization of the United Nations,聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織糧農(nóng)組織),FDA(Food and Drug Administration,食品藥品監(jiān)督管理局),WHO(World Health Organization,世界衛(wèi)生組織)

圖3 cPCR、qPCR和dPCR國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比Fig.3 Comparison of domestic standards for cPCR,qPCR and dPCRA.classification by number of detection types in standard(標(biāo)準(zhǔn)中按檢測(cè)類(lèi)型數(shù)量分類(lèi)),B.comparing cPCR,qPCR and dPCR to classify the number of detected objects(cPCR、qPCR、dPCR檢測(cè)對(duì)象數(shù)量分類(lèi)),C.standards of cPCR,qPCR and dPCR in different years(不同年度的cPCR、qPCR、dPCR標(biāo)準(zhǔn)情況),D.proportion of cPCR,qPCR and dPCR in total standard quantity(cPCR、qPCR、dPCR在總標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量中的比例)

與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)相比，我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)別[17]種類(lèi)匹配和分析物數(shù)量更為全面(表1)，F(xiàn)DA[18]和FAO/WHO[19]僅提供了較為有限數(shù)量的目標(biāo)分析物。進(jìn)一步對(duì)比這些分析物在檢測(cè)方法上的差異，發(fā)現(xiàn)基于PCR方法的轉(zhuǎn)基因和微生物是占比較大的兩類(lèi)(圖3A)，目前的標(biāo)準(zhǔn)以cPCR和qPCR方法為主(圖3D)，qPCR方法在動(dòng)植物源的檢測(cè)中占比最大，cPCR在轉(zhuǎn)基因的定性篩選方面成本較低，標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量較多(圖3B);近年來(lái)基于dPCR技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)有所增加(圖3C)，其在轉(zhuǎn)基因、微生物和動(dòng)植物源檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方面的數(shù)量分別為11種、8種、0種，而目前dPCR技術(shù)可為更多目標(biāo)分析物的研究提供可靠性依據(jù)，為建立更多的dPCR檢測(cè)方法提供了支持。

3 數(shù)字PCR(dPCR)在食品分析中的應(yīng)用進(jìn)展

近年來(lái)dPCR在轉(zhuǎn)基因、動(dòng)植物源和微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用，以及dPCR和qPCR對(duì)不同分析物檢測(cè)方法的比較研究成為熱點(diǎn)。以下對(duì)dPCR在上述相關(guān)檢測(cè)方面的研究進(jìn)行了總結(jié)。

3.1 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因生物的普及，轉(zhuǎn)基因生物面臨著越來(lái)越多的食品安全相關(guān)的社會(huì)壓力，制定合理的標(biāo)準(zhǔn)以及提供可靠的檢測(cè)方法對(duì)規(guī)范轉(zhuǎn)基因食品有著重要的意義。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因作物有抗除草劑類(lèi)和抗蟲(chóng)類(lèi)，具體見(jiàn)表2。

目前常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法為傳統(tǒng)PCR定性分析以及qPCR定量分析。qPCR和dPCR可用于轉(zhuǎn)基因元件或品系的定量檢測(cè)。qPCR結(jié)果受轉(zhuǎn)基因核酸含量及基質(zhì)影響偏大，而dPCR受此影響較小，因而更適合待測(cè)物中微量轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)，且有較好的靈敏度和拷貝數(shù)分辨精度[20]。Kosir等采用多重dPCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法對(duì)同一樣本中的內(nèi)、外源基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，避免了多次取樣的誤差，并且使得操作更加簡(jiǎn)單，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間[21]。

表2 數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法及使用材料Table 2 Digital PCR detection of transgenic genes and material used

(續(xù)表2)

*ddPCR:droplet digial PCR(微滴數(shù)字PCR)；cdPCR：camber digital PCR(微孔數(shù)字PCR)

3.2 動(dòng)物源摻雜

動(dòng)物源和植物源的摻雜檢測(cè)是基于DNA檢測(cè)的另一重要應(yīng)用方向。肉制品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中有意或無(wú)意摻雜未標(biāo)明的肉類(lèi)成分已成為全球面臨的食品安全熱點(diǎn)問(wèn)題。在動(dòng)物源摻雜的報(bào)道[50]中，不僅存在在高價(jià)格的肉制品(如豬肉、牛肉、羊肉)中摻雜廉價(jià)肉制品(如雞肉、鴨肉等)的情況，更有直接加入一定比例的低價(jià)肉制品的現(xiàn)象。這些未標(biāo)明的肉制品成分不僅損害了消費(fèi)者的利益，而且?guī)?lái)食品安全隱患。

數(shù)字PCR可為動(dòng)物源成分的精確定量及準(zhǔn)確區(qū)分摻雜提供解決途徑。其定量方式可分為兩種：一種方法是通過(guò)數(shù)字PCR測(cè)定動(dòng)物源成分的準(zhǔn)確拷貝數(shù)，計(jì)算得到拷貝數(shù)與樣本質(zhì)量的比例數(shù)(用%表示)。然后通過(guò)與目標(biāo)動(dòng)物源成分的標(biāo)準(zhǔn)比例數(shù)比較，判斷待測(cè)樣品中所含目標(biāo)動(dòng)物源成分的摻雜情況。這種方法需要建立龐大的拷貝數(shù)/質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)，且不同種類(lèi)的肉制品拷貝數(shù)與質(zhì)量的比例數(shù)差異較大；另一種方法是直接用拷貝數(shù)比例數(shù)據(jù)作為判別摻雜的依據(jù)，即從不同種類(lèi)動(dòng)植物組織或含有動(dòng)植物的食品中提取核酸后，測(cè)算單位質(zhì)量各個(gè)種類(lèi)的目標(biāo)基因拷貝數(shù)比值，建立基因拷貝數(shù)與質(zhì)量之間的關(guān)系，利用該比例關(guān)系(轉(zhuǎn)換因子)換算出可能的不同種類(lèi)物質(zhì)添加量，從而實(shí)現(xiàn)動(dòng)植物源性成分的定量檢測(cè)。

Qiang等[47]對(duì)5種不同種類(lèi)的山羊和綿羊肉類(lèi)中24種肉制品摻雜進(jìn)行分析，檢測(cè)限達(dá)1copy/μL(山羊)和5copies/μL(綿羊)，且在多種肉類(lèi)摻雜中特異性表現(xiàn)良好。任君安[48]采用四重、五重?cái)?shù)字PCR分析羊肉中的4種摻雜肉類(lèi)成分，并發(fā)現(xiàn)反應(yīng)進(jìn)行程度受溫度、壓力等環(huán)境影響較小，數(shù)字PCR方法的線性范圍寬(摻雜率1%～90%)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于25%。

Koppel等[49]通過(guò)將肉制樣品和與其相似的參考物質(zhì)用轉(zhuǎn)換因子聯(lián)系起來(lái)，將數(shù)字PCR得到的拷貝數(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換成質(zhì)量百分比，對(duì)豬肉和牛肉的摻雜進(jìn)行了分析。在隨后的工作中，Koppel等基于微滴數(shù)字PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)了牛肉、豬肉、雞肉、火雞、綿羊和馬肉6種肉制品在煮熟香腸基質(zhì)中的比例，使用6家實(shí)驗(yàn)室的環(huán)形比對(duì)得到的每種肉制品的平均轉(zhuǎn)換因子進(jìn)行轉(zhuǎn)換后，取得待測(cè)香腸肉制品中添加的6種肉的比例估計(jì)。與實(shí)時(shí)PCR結(jié)果相比(不確定度30%)，數(shù)字PCR具有較高的準(zhǔn)確性(不確定度10%)[50]。

王強(qiáng)等[51]對(duì)9種鵝肉及其他21種添加肉制品進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)將實(shí)測(cè)數(shù)字PCR拷貝數(shù)代入樣品質(zhì)量與靶基因拷貝數(shù)，得到方法檢出限為L(zhǎng)OD95%為1 copy/μL。Noh等[52]將微滴數(shù)字PCR用于混合魚(yú)醬產(chǎn)品中阿拉斯加狹鱈魚(yú)(Gadus chalcogrammus)的定量分析，混合樣品重量與DNA濃度的關(guān)系無(wú)顯著性差異，實(shí)驗(yàn)偏差較低。上述研究表明ddPCR在混合樣品的檢測(cè)中具有較好的準(zhǔn)確性。

3.3 植物源摻雜

與動(dòng)物源相類(lèi)似，植物源食品也存在成分摻雜的情況。楊碩等[53-54]從植物組織或植物蛋白飲料中提取核酸后，進(jìn)一步對(duì)比了椰子汁中的大豆和花生成分，并使用熒光實(shí)時(shí)PCR和數(shù)字PCR同時(shí)對(duì)6組樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明數(shù)字PCR結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性，可以減少假陽(yáng)性幾率。劉二龍等[55]對(duì)紅薯中的紫薯、木薯、馬鈴薯、藕、芋頭、豌豆、高粱、胡羅卜、番茄、大米、大豆和大麥作物等12種摻雜成分進(jìn)行了測(cè)定，可對(duì)質(zhì)量百分比為5%以上的紅薯成分進(jìn)行定量測(cè)定，精密度(RSD)≤25%，檢出限(LOD)為2.53 copies/μL。

3.4 微生物檢測(cè)

病原微生物是食品安全檢測(cè)中常見(jiàn)的致病因素，包括細(xì)菌、病毒和支原體等。傳統(tǒng)分析方法有基體培養(yǎng)鏡檢、免疫方法和分子方法。與這些方法相比，數(shù)字PCR分析時(shí)間更短且不因基質(zhì)中組成成分產(chǎn)生抑制反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度高。目前已有報(bào)道使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)沙門(mén)桿菌[56-57]、金黃色葡萄球菌[58]、李斯特氏菌[59]、副溶血性弧菌[60]、豬圓環(huán)病毒[61-62]等常見(jiàn)微生物進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，并制定了相關(guān)的數(shù)字PCR方法行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。董蓮華等[63]建立了大腸桿菌E.coliO157:H基因組DNA微滴數(shù)字PCR檢測(cè)體系，對(duì)5株非大腸桿菌和5株大腸桿菌O517:H7血清型的菌株基因組DNA 進(jìn)行了方法特異性驗(yàn)證，并對(duì)豬肉、牛肉、雞肉等13份市售肉制品進(jìn)行E.coliO157:H檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果與熒光PCR方法一致。方佩佩等[64]以不耐熱溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)為靶基因建立了17種混合菌種微滴數(shù)字PCR技術(shù)方法，測(cè)定了鱈魚(yú)中的副溶血性弧菌含量，方法特異性良好，檢測(cè)時(shí)間由稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)(Most probable number,MPN)定量方法的3～5 d縮短至3～5 h。

Nshimyimana[65]及Staley[66]等使用微滴數(shù)字PCR對(duì)微生物來(lái)源進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明數(shù)字PCR具有更好的特異性及靈敏度，是一種合適的測(cè)定微生物來(lái)源的方法。Palumbo等[67]在葡萄和葡萄干的生產(chǎn)過(guò)程中利用幾種真菌毒素的鈣調(diào)蛋白基因序列差異，使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所得葡萄不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同葡萄種植園的數(shù)字PCR監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)可提供該地區(qū)的實(shí)時(shí)情況，并預(yù)測(cè)后期的生長(zhǎng)、豐收情況。

Liu等[68]證明熒光PCR和數(shù)字PCR在柑橘黃脈清除病毒(CYVCV)的檢測(cè)中均具有較好的線性，但數(shù)字PCR具有更好的靈敏度，是熒光PCR的100倍。Jahne等[69]利用熒光PCR和微滴數(shù)字PCR測(cè)定了中水和廢水中的諾如病毒和腺病毒，結(jié)果顯示微滴數(shù)字PCR的靈敏度(中水中GⅡ型諾如病毒檢測(cè)靈敏度4%，腺病毒檢測(cè)靈敏度 14%)高于熒光PCR，與前期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[70]。Morella等[71]在對(duì)病毒(噬菌體)的研究中，認(rèn)為微滴數(shù)字PCR是一種更快速、低消耗、高通量的檢測(cè)方法，建議廣泛應(yīng)用在噬菌體的檢測(cè)中。

Maheshwari等[72]使用數(shù)字PCR和熒光PCR方法對(duì)柑橘類(lèi)中支原體檸檬螺旋體的SP1和ORF1基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于SP1，數(shù)字PCR的檢測(cè)靈敏度(0.000 01 ng)高于熒光PCR(0.000 1 ng)，兩種方法檢測(cè)ORF1的靈敏度相同。Bahder等[73]對(duì)棕櫚樹(shù)中的16SrIV-A和16SrIV-D 型植原體進(jìn)行數(shù)字PCR(TaqMan)檢測(cè)，同時(shí)與熒光PCR和巢式PCR(nested PCR，nPCR)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，數(shù)字PCR擁有更低的檢出限，在0.000 1%原始提取液稀釋液中檢出目標(biāo)物，而熒光PCR在0.1%原始提取液稀釋液中檢出，巢式PCR在0.01%原始提取液稀釋液中檢出(同位素稀釋方法定量)。

4 結(jié)論與展望

文獻(xiàn)整理和分析表明，數(shù)字PCR技術(shù)適用于轉(zhuǎn)基因、動(dòng)植物源和微生物的檢測(cè)，具有較高靈敏度，但對(duì)于不同分析物，數(shù)字PCR與熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用評(píng)價(jià)不同，其中數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因、動(dòng)物源、部分植物源和微生物的文獻(xiàn)報(bào)道中具有更高靈敏度以及對(duì)抑制成分的抗干擾能力[74]。

但數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用受到方法穩(wěn)定性、儀器操作等多因素的制約，楊冬燕等[75]的研究表明，在廚房廢棄油脂的實(shí)驗(yàn)中，數(shù)字PCR在靈敏度和準(zhǔn)確率方面具有優(yōu)勢(shì)，但其方法穩(wěn)定性和精密度不及熒光PCR，導(dǎo)致應(yīng)用優(yōu)勢(shì)不明顯。因此，與技術(shù)和產(chǎn)業(yè)都相對(duì)成熟的熒光PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)仍然有探索和改進(jìn)的空間。此外，準(zhǔn)確定量檢測(cè)需要多種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的支持[76]，而目前國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較少，無(wú)論是研究還是檢測(cè)，都需要購(gòu)買(mǎi)大量國(guó)外商用轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心(ERM)、歐盟標(biāo)準(zhǔn)局(IRMM)、美國(guó)油脂化學(xué)協(xié)會(huì)(AOCS)、日本廠商以及一些國(guó)外試劑公司的標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致數(shù)字PCR技術(shù)使用成本昂貴，不利于技術(shù)的完善與應(yīng)用。

無(wú)需依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量，以及對(duì)低含量核酸樣品檢測(cè)的高準(zhǔn)確度使數(shù)字PCR技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。目前制約其發(fā)展的因素主要為標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴和缺少標(biāo)準(zhǔn)方法。由于數(shù)字PCR方法與多數(shù)熒光定量PCR方法具有兼容性，使得可用于數(shù)字PCR的目標(biāo)分析物和適用方法不斷積累，并應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。數(shù)字PCR可與化學(xué)分析方法相互輔助得到趨于完整的信息。未來(lái)將有更多的實(shí)驗(yàn)室將數(shù)字PCR方法納入ISO 17025，數(shù)字PCR將應(yīng)用到越來(lái)越多的食品安全檢測(cè)中并發(fā)揮更加重要的作用。