王興龍，蔡 強(qiáng)，諸 寅，保 聰，桂文鋒，任一平*

(1.浙江清華長(zhǎng)三角研究院 分析測(cè)試中心，浙江 嘉興 314000；2.瓦赫寧根大學(xué) 海洋動(dòng)物生態(tài)組，海爾德蘭 瓦赫寧根 6708 WD，荷蘭;3.上海師范大學(xué) 環(huán)境與地理科學(xué)學(xué)院，上海 200233)

河豚毒素(Tetrodotoxins,TTXs)是一類毒性非常強(qiáng)的小分子海洋生物毒素，目前發(fā)現(xiàn)天然存在的種類超過40余種，其中TTX毒性較強(qiáng)，大約2 mg即可將50 kg體重的成年人致死[1-2]，且一般的烹飪溫度很難降低其毒性。TTX同時(shí)擁有胍基和鄰位酸官能團(tuán)，通常以內(nèi)鹽形式存在，故其在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下性質(zhì)均不穩(wěn)定。它們作用于細(xì)胞膜上的鈉離子通道，影響動(dòng)作電位的傳導(dǎo)，產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等急性中毒癥狀，從而導(dǎo)致死亡[3]。與某些微藻來源的海洋毒素不同，TTX通過食物鏈聚集或與其共生的微生物產(chǎn)生，涉及的微生物包括假單胞菌屬、弧菌屬、希瓦氏菌屬、芽孢桿菌屬等[4-5]。近年來，我國(guó)浙江[6]、福建[7-8]、廣東[9]、四川[10]等地發(fā)生多起誤食河豚魚、織紋螺的中毒事件。河豚毒素中毒后無特效治療藥物[11]。我國(guó)暫未設(shè)定水產(chǎn)品中TTX的限量，而日本、韓國(guó)設(shè)定河豚魚可食部分中TTX的限量為 2 mg/kg[4]。歐盟禁止河豚魚流入市場(chǎng)，規(guī)定貝類組織中TTX的含量低于44 μg/kg[12]。伴隨河豚市場(chǎng)的開放以及水產(chǎn)品中TTX風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的不斷深入，我國(guó)水產(chǎn)品中TTX的限量標(biāo)準(zhǔn)將會(huì)不斷完善，檢測(cè)目標(biāo)逐漸實(shí)現(xiàn)由單一向多種類同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)變，復(fù)雜耗時(shí)的前處理技術(shù)向簡(jiǎn)單、高效方向轉(zhuǎn)變。

河豚毒素的檢測(cè)方法主要有小鼠生物法[2,13]、酶聯(lián)免疫吸附法[14]、免疫層析法[15-17]、液相色譜-熒光檢測(cè)法[18-19]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18,20]等。小鼠生物法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但易受個(gè)體差異的影響，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法特異性強(qiáng)，靈敏度高，定性檢測(cè)方面優(yōu)勢(shì)明顯，但標(biāo)記物的穩(wěn)定性較難控制。液相色譜-熒光檢測(cè)法與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有分離度好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但均需衍生，且前處理過程繁瑣。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法無需衍生化處理，具有選擇性好、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)多種TTX類似物同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為河豚毒素的首選檢測(cè)方法。目前，水產(chǎn)品中河豚毒素定量檢測(cè)主要針對(duì)1種TTX，樣品前處理多采用反向固相萃取柱、超濾離心柱、免疫親和柱等。由于商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)品僅有河豚毒素(TTX)與4,9-脫水河豚毒素(4,9-anhTTX)(化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1)，且兩種毒素可能會(huì)存在于同一樣品中，為全面掌握河豚毒素的污染狀況，需建立這兩種河豚毒素同時(shí)定量檢測(cè)的方法。

現(xiàn)有河豚毒素檢測(cè)的前處理技術(shù)復(fù)雜、耗時(shí)，無法滿足批量樣品快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)需求。針對(duì)這一現(xiàn)狀，本研究?jī)?yōu)化了稀釋溶劑、稀釋倍數(shù)、液相色譜及質(zhì)譜檢測(cè)等條件，建立了測(cè)定河豚魚與織紋螺中TTX與4,9-anhTTX的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。本方法簡(jiǎn)單、高效、成本低，適用于批量河豚魚、織紋螺中河豚毒素的檢測(cè)。

圖1 河豚毒素與4,9-脫水河豚毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of TTX and 4,9-anhTTX

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與耗材

Acquity H超高效液相色譜儀、Waters TQD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)沃特世公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore 公司)；渦旋振蕩器(德國(guó)海道夫公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；免疫親和凈化柱(江蘇美正生物科技有限公司)。

TTX和4,9-anhTTX混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(西班牙Laboratorio CIFGA S.A.)；乙腈、甲醇(均為色譜純,德國(guó)Merck公司)；甲酸、乙酸、甲酸銨(均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，0.22 μm尼龍針式濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；超純水(由Milli-Q超純水儀制備)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 TTX標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液移取適量的TTX標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用1 mmol/L乙酸稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。

1.2.2 4,9-anhTTX標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液移取適量的 4,9-anhTTX標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用1 mmol/L乙酸稀釋至5 mL，配制成質(zhì)量濃度為200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別準(zhǔn)確移取適量的TTX、4,9-anhTTX標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用1 mmol/L乙酸逐級(jí)稀釋，配制成0.5、2、10、50、100 μg/L的TTX標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與0.5、1、5、20、50 μg/L的4,9-anhTTX標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件ACQUITY BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為0.4 mL/min；流動(dòng)相：A為0.5 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液。洗脫條件：0～1.0 min，20%A；1.0～5.0 min，20%～50%A；5.0～7.0 min，50%A；7.0～9.5 min，20%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件正離子掃描，電噴霧離子源(ESI)，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔反吹氣流速為30 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)采集。

1.4 樣品前處理

1.4.1 直接稀釋法稱取2 g(精確至 0.01 g)試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL乙酸-甲醇(1∶99)溶液，旋轉(zhuǎn)振蕩提取20 min后，以8 500 r/min離心10 min。準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.1 mL上清液于5 mL離心管中，加入2.9 mL 80%甲醇水溶液，旋渦混勻后，在4 ℃下以11 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.4.2 免疫親和柱凈化法準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移1 mL 前述上清液于15 mL聚丙烯離心管中，加入9 mL水混勻，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7～8，待凈化。將免疫親和柱回溫至室溫，放出柱內(nèi)保存液后，待凈化液全部上樣。凈化液全部流出后，用10 mL水淋洗，4 mL乙酸-甲醇溶液(2∶98)洗脫，收集洗脫液于45 ℃氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇水溶液溶解并定容至1 mL，過0.22 μm的有機(jī)相微孔濾膜，待上機(jī)。

圖2 80%甲醇對(duì)溶劑效應(yīng)的影響Fig.2 Influence of 80% methanol on solvent effect

2 結(jié)果與討論

2.1 稀釋溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣體積一定時(shí)，進(jìn)樣溶液中甲醇比例越低，溶劑效應(yīng)越明顯。以10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品為例，通過改變稀釋溶液中甲醇的比例(50%、60%、70%、80%)，對(duì)2種河豚毒素的溶劑效應(yīng)進(jìn)行了考察。由圖2可知，當(dāng)甲醇比例達(dá)到80%時(shí)，可明顯消除溶劑效應(yīng)，因此確定稀釋溶劑為80%甲醇。

2.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

流動(dòng)相pH值影響B(tài)EH Amide色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物的保留以及儀器的響應(yīng)強(qiáng)度。當(dāng)流動(dòng)相中甲酸濃度為0.1%時(shí)，考察了水相中不同濃度甲酸銨(0、0.2、0.5、1、2 mmol/L)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液出峰時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甲酸銨濃度的增大，響應(yīng)強(qiáng)度減小，出峰時(shí)間延長(zhǎng)。當(dāng)甲酸銨濃度為2 mmol/L時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度約為未加甲酸銨的1/2；當(dāng)甲酸銨濃度為0時(shí)，雖具有最強(qiáng)的響應(yīng)強(qiáng)度，但樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰出峰時(shí)間不一致，偏差為0.15 min。當(dāng)甲酸銨濃度為0.5 mmol/L時(shí)，樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間一致，響應(yīng)強(qiáng)度未受明顯影響，所以水相中甲酸銨的濃度選擇為0.5 mmol/L。

2.3 稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

河豚魚、織紋螺基質(zhì)中含大量的蛋白質(zhì)、脂肪、其他雜質(zhì)等成分，在ESI+模式下，目標(biāo)物的離子化效率易受到干擾，從而影響定量檢測(cè)。比較了不同稀釋倍數(shù)(100、200、300倍)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，將織紋螺、河豚魚空白樣品按照本方法處理后，獲得空白基質(zhì)溶液，配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用下式評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)：ME/%=(B-A)/A×100%[21]，式中A、B分別為標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)ME=0時(shí)，表明無基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME<0 時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)減弱；當(dāng)ME>0 時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)。結(jié)果表明，稀釋倍數(shù)為100、200和300倍時(shí)的ME均小于0，說明基質(zhì)效應(yīng)使得響應(yīng)信號(hào)降低，且伴隨稀釋倍數(shù)的增加，基質(zhì)效應(yīng)減弱。當(dāng)稀釋倍數(shù)為300時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)為-14%～-2.5%，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮方法靈敏度與減少儀器污染，將稀釋倍數(shù)設(shè)為300倍，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.4 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在ESI+模式下，對(duì)200 μg/L的TTX與4,9-anhTTX標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，得到每種目標(biāo)物的母離子。然后選用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR)模式，比較不同錐孔電壓下母離子的響應(yīng)強(qiáng)度，確定最大響應(yīng)值時(shí)為最佳錐孔電壓。再選用子離子(Daughter)掃描模式，比較不同碰撞能量下子離子的響應(yīng)強(qiáng)度，選擇響應(yīng)強(qiáng)度較高的兩個(gè)離子作為定量離子和定性離子，對(duì)應(yīng)的碰撞能量為最佳優(yōu)化值。TTX與4,9-anhTTX的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 TTX及4,9-anhTTX的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of TTX and 4,9-anhTTX

*quantitative ion

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍、檢出限與定量下限按“1.4.1”方法得到織紋螺、河豚魚的空白基質(zhì)溶液，逐級(jí)稀釋2種河豚毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X,μg/L)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別以3倍信噪比(LOD，S/N≥3)和10倍信噪比(LOQ，S/N≥10)確定方法檢出限與定量下限，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，在河豚魚和織紋螺基質(zhì)中，TTX與4,9-anhTTX分別在0.5～100 μg/L、0.5～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99；LOD分別為100、150 μg/kg,LOQ分別為300、450 μg/kg，可以滿足日常檢測(cè)的需求。

表2 2種河豚毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of 2 TTXs

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度以2種河豚毒素為目標(biāo)物，對(duì)河豚魚、織紋螺空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為300、500、1 000 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)濃度平行測(cè)定6次，考察方法的準(zhǔn)確度。方法精密度則通過日內(nèi)、日間(連續(xù)重復(fù)3 d)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示，結(jié)果見表3。2種河豚毒素在河豚魚、織紋螺基質(zhì)中3個(gè)加標(biāo)濃度的回收率為75.4%～96.8%，日內(nèi)、日間RSD均小于10%，說明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

表3 2種河豚毒素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 2 TTXs

圖3 兩種前處理方式對(duì)河豚毒素的回收率(n=6)Fig.3 Recoveries of TTXs with different processing methods(n=6)

2.6 前處理方法的比較

GB 5009.206-2016[22]中采用免疫親和柱凈化的前處理方式，本研究利用簡(jiǎn)單、快速的直接提取、稀釋、冷凍離心的方法進(jìn)行前處理，通過空白基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，比較了兩種前處理方法的回收率、基質(zhì)效應(yīng)和靈敏度。由圖3可知，直接稀釋法的回收率高于免疫親和柱凈化法，可能是其避免了過程損失，提高了方法準(zhǔn)確度。但免疫親和柱凈化后，基本無基質(zhì)效應(yīng)，且具有富集目標(biāo)物的作用，所以靈敏度比直接稀釋法高。根據(jù)日本、韓國(guó)對(duì)河豚魚可食部分中TTX的限量要求，本方法的檢出限可滿足要求。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看，河豚魚樣品的加標(biāo)回收率高于織紋螺，可能由于織紋螺基質(zhì)更加復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)更強(qiáng)所致。

2.7 實(shí)際樣品分析

利用優(yōu)化后的方法對(duì)2017年3月于東海捕獲的7種河豚魚(34條)不同組織中的TTX、4,9-anhTTX進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4。結(jié)果顯示，不同種類的河豚魚體內(nèi)TTX、4,9-anhTTX的含量相差較大，月腹刺豚組織中含量最高，其中TTX總含量為60.6 mg/kg，4,9-anhTTX總含量為1.6 mg/kg，超出日本對(duì)河豚魚的限量(2.2 mg/kg)。刺豚的毒素含量最低，各組織均未檢出。同種魚類，不同組織中所含毒素差異也較大。大部分毒素集中于魚卵、魚肝中，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果相一致[23]，此研究結(jié)果可為有條件開放河豚市場(chǎng)提供參考。同時(shí)應(yīng)用本方法對(duì)2017～2018年浙江省沿海地區(qū)采集的21份織紋螺樣品進(jìn)行檢測(cè)，TTX的檢出率為95.2%，含量為0.15～16.36 mg/kg；4,9-anhTTX的檢出率為27.6%，含量為0.14～1.56 mg/kg。整體來看，織紋螺中河豚毒素含量也較高，存在很大的安全隱患。

圖4 不同河豚魚組織中河豚毒素的含量Fig.4 Amounts of TTXs in different kinds of puffer fish tissue

3 結(jié) 論

本研究采用沉淀、提取、離心、稀釋的快速前處理方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定河豚魚與織紋螺中2 種河豚毒素的含量。本方法前處理過程簡(jiǎn)單、高效，降低了檢測(cè)成本，避免了目標(biāo)物的損失，適合批量樣品中河豚毒素的快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)。