杜欽芝，金 琳，賀 瑩，陳時洪*

(1.重慶市第八中學(xué)校 重慶 400030；2.西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

電致化學(xué)發(fā)光(ECL)是一種結(jié)合電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光優(yōu)點的新型檢測技術(shù)。由于具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、成本低及易于控制等優(yōu)點，ECL已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物分析、環(huán)境檢測、食品檢測以及臨床診斷等領(lǐng)域[1]。

高發(fā)光效率的ECL發(fā)光體是獲得靈敏ECL檢測的前提。目前常用的ECL發(fā)光體有魯米諾[2]、異魯米諾[3]、聯(lián)吡啶釕及其衍生物[4]、量子點[5]、類石墨相氮化碳[6]、苝類化合物[7]以及金屬納米簇[8]?；谶@些發(fā)光體的ECL分析一般需要外加共反應(yīng)試劑或以溶解氧作為共反應(yīng)試劑以獲得高的ECL發(fā)光效率。近年來，聚芴類作為一種新型的ECL發(fā)光體，由于其高的熒光量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性已被廣泛應(yīng)用于分析檢測[9]。聚[(9,9-二辛基芴基-2,7-二基)-co-(1,4-苯并-{2,1′,3}-噻二唑](PFBT) 屬于聚芴類化合物中的一種，在ECL傳感及成像中已受到關(guān)注[10]。本課題組在最近的研究中進一步發(fā)現(xiàn)，羧基功能化的PFBT聚合物點(PFBT-COOH)在無外加共反應(yīng)試劑和除溶解氧的情況下具有強的ECL發(fā)光效率[11]，這極大擴展了PFBT在ECL分析領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本文采用PFBT-COOH作為ECL發(fā)光體，以其修飾電極，在EDC/NHS作用下與GOD交聯(lián)，以實現(xiàn)酶的固載而制得ECL酶生物傳感器?；贕OD催化底物葡萄糖原位產(chǎn)生的H2O2對PFBT-COOH中ECL信號的高效猝滅作用，可實現(xiàn)對葡萄糖的靈敏檢測。PFBT-COOH與猝滅劑H2O2的結(jié)合擴展了聚芴類化合物在ECL傳感領(lǐng)域，特別是在ECL酶傳感領(lǐng)域的應(yīng)用，為葡萄糖檢測提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器公司)和CHI760E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)分別用于ECL和循環(huán)伏安(CV)測試，ECL檢測時，掃描電壓范圍和光電倍增管電壓分別設(shè)置為0～+1.25 V和800 V；納米材料的微觀形貌采用S-4800掃描電子顯微鏡(SEM，日本日立公司)進行表征；尼古萊IS 10傅里葉變換紅外光譜(FI-IR，美國尼古拉公司)和紫外可見分光光度計(UV-vis)(Lambda 17，美國PerkinElmer公司)用于表征納米材料的光學(xué)性質(zhì)。

PFBT(MW～134 000，多分散性3.5)由ADS染料源公司(加拿大魁北克)提供；聚(苯乙烯-共馬來酸酐)(PSMA，平均分子量～1 700)和尿酸購自上海阿拉丁公司；葡萄糖(一水)(Glu)、乳糖、蔗糖和抗壞血酸均購自成都市科龍化工有限公司；葡萄糖氧化酶(GOD)、N-(3-(二甲基氨基)丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀亞胺(NHS)均購自美國Sigma公司；L-半胱氨酸(L-Cysteine)和超氧化物歧化酶(SOD)由北京百靈威科技有限公司提供；測試底液為0.10 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)；所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 PFBT-COOH的制備

分別將PFBT(4.0 mg)和PSMA(0.8 mg)溶于四氫呋喃(THF)中，強力超聲5.0 h以上得到1.0 mg/mL溶液，然后將兩種溶液充分混合并迅速注入10.0 mL水中。將混合溶液連續(xù)攪拌，直至溶劑THF在真空下完全蒸發(fā)后，通過440 nm針筒式濾膜過濾器去除大顆粒聚集體,得到PFBT-COOH分散液。

1.3 傳感器的制備

依次用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末打磨玻碳電極(GCE，直徑4.0 mm)表面，再依次用水、無水乙醇和水超聲清洗GCE。待GCE在空氣條件下自然晾干后，在其表面滴加7.0 μL PFBT-COOH分散液。室溫下晾干后，再滴加10.0 μL EDC/NHS(4∶1) 交聯(lián)劑，室溫避光條件下孵育1.0 h，以活化 PFBT-COOH的羧基官能團。最后滴加10.0 μL GOD溶液(10 mg/mL,0.10 mol/L PBS,pH 7.4)，于4.0 ℃避光條件下孵育8.0 h，得到GOD/PFBT-COOH/GCE酶生物傳感器，于4.0 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩鞲衅鞯臉?gòu)建過程如圖1所示。

圖1 ECL傳感器的制備及響應(yīng)原理圖Fig.1 Schematic description of preparation and response of the ECL biosensor

1.4 檢測方法

工作電極(修飾的GCE)、參比電極(Ag/AgCl電極)和對電極(鉑絲電極)構(gòu)成三電極檢測系統(tǒng)。在3.0 mL PBS測試底液中，在0～+1.25 V范圍內(nèi)，以300 mV/s的掃速掃描以采集ECL信號。在鐵氰化鉀溶液(K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]，5.0 mmol/L)中，在-0.20 ～+0.60 V范圍內(nèi)，以100 mV/s的掃速掃描以采集循環(huán)伏安(CV)信號。

2 結(jié)果與討論

2.1 PFBT-COOH的表征

用SEM表征了PFBT-COOH的微觀形貌，結(jié)果如圖2A所示?？汕逦^察到球形的PFBT-COOH聚合物點，其直徑為60 ～ 80 nm，平均直徑為70 nm。所制備材料的形貌和粒徑大小與文獻相符[11]。用IR技術(shù)表征了未羧基化的PFBT及PFBT-COOH的IR光譜。如圖2B所示，與PFBT相比，PFBT-COOH的IR光譜在1 777.52 cm-1處出現(xiàn)1個新的吸收峰，為—COOH官能團的特征吸收峰。圖2C為PFBT-COOH的UV-Vis吸收光譜,可觀察到PFBT-COOH在300～600 nm范圍內(nèi)顯示出較寬的吸收帶，這歸因于聚合物鏈的塌陷和彎曲，從而導(dǎo)致較低的共軛度[20]。 PFBT-COOH的2個特征吸收峰分別位于320 nm和455 nm。所得到的UV-Vis光譜與文獻相符[20]。IR光譜中1 777.52 cm-1處的—COOH吸收峰證明材料被成功的羧基化，結(jié)合SEM圖和UV-Vis光譜，表明材料已成功合成。

圖2 PFBT-COOH的SEM圖(A)、紅外光譜(B)及紫外可見光譜(C)Fig.2 SEM image(A),IR spectra(B) and UV-Vis absorption spectrum(C) of PFBT-COOH

2.2 PFBT-COOH的ECL行為

圖3 PFBT-COOH/GCE在0.10 mol/L PBS(pH 7.4)溶液中的ECL響應(yīng)(A) ，以及pH值對PFBT-COOH/GCE的ECL響應(yīng)的影響(B)Fig.3 ECL response of PFBT-COOH/GCE in 0.10 mol/L PBS(pH 7.4) solution(A) and effect of pH value on ECL response of PFBT-COOH/GCE(B)a.with air-saturated atmosphere,b.with N2 atmosphere,c.with air-saturated atmosphere+L-cysteine,d.with air-saturated atmosphere+SOD;scanning potential range:0 ～+1.25 V,scanning rate:300 mV/s

圖4 傳感器的CV(A)和EIS(B)表征Fig.4 CV(A) and EIS(B) characterizations of the biosensora.bare GCE,b.PFBT-COOH/GCE,c.GOD/PFBT-COOH/GCE

2.3 電極修飾過程的表征

在含有K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](5.0 mmol/L)的PBS溶液中，測試了不同修飾電極的CV曲線和電化學(xué)阻抗(EIS)圖譜以表征傳感器的組裝過程。CV表征結(jié)果示于圖4A。可見，裸電極(GCE)呈現(xiàn)出一對較好的可逆的[Fe(CN)6]3-/4-氧化還原峰(曲線a)。當(dāng)PFBT-COOH修飾至電極表面后，相應(yīng)的氧化還原峰電流值顯著下降(曲線b)，這是因為PFBT-COOH的導(dǎo)電性差，阻礙了信號探針[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面之間的電子傳遞。當(dāng)葡萄糖氧化酶(GOD)通過交聯(lián)被修飾到電極表面后，由于非導(dǎo)電性生物大分子GOD對電子傳遞的阻礙作用，相應(yīng)的峰電流進一步減小(曲線c)。圖4B為電極修飾過程的EIS表征。由圖可見，隨著PFBT-COOH和GOD在GCE表面的逐步修飾，其EIS圖譜中的半圓直徑逐漸增大，表明交流阻抗值逐漸增大，這主要是因為PFBT-COOH和生物大分子GOD阻礙了信號探針[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面的電子傳遞過程，這與CV表征所呈現(xiàn)的變化規(guī)律一致。傳感器的CV和EIS表征結(jié)果也均表明其已成功構(gòu)建。

圖5 不同pH條件下傳感器的ECL信號強度Fig.5 ECL signal strengths of the biosensor under different pH conditions

圖6 傳感器對不同濃度葡萄糖的ECL響應(yīng)Fig.6 ECL response of the biosensor towards different concentration of glucose glucose concentration(a-g):1.0×10-7,3.0×10-6,2.0×10-5,5.0×10-5,1.0×10-4,5.0×10-4,1.0×10-3 mol/L;insert:the calibration plot for ECL intensity vs.logarithm of glucose concentration

2.4 pH值的優(yōu)化

由于pH會顯著影響酶的活性，所以探究了PBS的pH值對生物傳感器(GOD/PFBT-COOH/GCE)的ECL響應(yīng)影響。圖5顯示了傳感器在不同pH條件下對0.50 mmol/L葡萄糖的ECL響應(yīng)情況。當(dāng)pH值由6.0增至7.4時，傳感器的ECL信號隨pH值的增大而逐漸降低，這是由于GOD催化葡萄糖原位產(chǎn)生的H2O2的量逐漸增加，對ECL信號的猝滅程度增大。當(dāng)pH為7.4時，生物傳感器的ECL信號達到最低，表明GOD的活性在此條件下最佳。此后，隨著pH值的升高，ECL信號不斷上升，這是由于GOD的活性下降，導(dǎo)致生成H2O2的量減少。因此，實驗選擇最佳pH值為7.4。

2.5 傳感器對葡萄糖的響應(yīng)

在最佳實驗條件下，測試了所構(gòu)建酶生物傳感器對葡萄糖的響應(yīng)，結(jié)果如圖6所示。ECL信號強度隨著葡萄糖濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)葡萄糖濃度在1.0×10-7～3.0×10-3mol/L范圍內(nèi)，可觀察到ECL信號強度(I)與葡萄糖濃度的對數(shù)(lgc)呈良好的線性關(guān)系(見插圖)。線性回歸方程為I=-2 129lgc-2 671，相關(guān)系數(shù)r=0.995 6，檢出限(S/N=3)為3.0×10-8mol/L。將本文所構(gòu)建傳感器的響應(yīng)性能與其它檢測葡萄糖的方法進行比較，結(jié)果如表1所示?？梢姡疚乃鶚?gòu)建的傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。

表1 檢測葡萄糖的不同方法比較Table 1 Comparison of different methods for the detection of glucose

*no data

2.6 傳感器的穩(wěn)定性與選擇性

穩(wěn)定性和選擇性是衡量傳感器性能的重要指標(biāo)。測試了傳感器在含有0.40 mmol/L葡萄糖的PBS(0.10 mol/L，pH 7.4) 溶液中連續(xù)掃描10圈，其ECL信號的變化情況(圖7A)。結(jié)果顯示，ECL信號無明顯變化，其ECL信號值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 2.1%，說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。選擇抗壞血酸(Ascorbic acid)、L-半胱氨酸(L-Cysteine) 、乳糖(Lactose)、蔗糖(Sucrose) 和尿酸(Uric acid) 作為潛在的干擾物質(zhì)，測試了所設(shè)計的ECL傳感器的選擇性。圖7B顯示了傳感器對各干擾物質(zhì)(濃度均為200 μmol/L)和葡萄糖(20 μmol/L)的ECL響應(yīng)情況?？梢?，即使干擾物的濃度為目標(biāo)物葡萄糖濃度的10倍，干擾溶液的ECL響應(yīng)信號與空白(Blank) 時的ECL響應(yīng)信號無明顯差異，而存在20 μmol/L葡萄糖時，ECL信號顯著下降。當(dāng)葡萄糖(20 μmol/L)與上述所有干擾物質(zhì)(濃度均為200 μmol/L)混合(Mixture) 時，ECL信號與只存在葡萄糖時的結(jié)果幾乎一致，上述結(jié)果表明該傳感器對葡萄糖具有優(yōu)良的選擇性。

圖7 傳感器的穩(wěn)定性(A)和選擇性(B)Fig.7 Stability(A) and selectivity(B) of the biosensor

2.7 實際樣品的分析

在優(yōu)化條件下，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法對人血清樣品進行回收實驗，以評估所構(gòu)建的ECL酶傳感器潛在的實際應(yīng)用能力。如表2所示，傳感器測定稀釋的人血清樣品中葡萄糖濃度為4.5 μmol/L。在稀釋的人血清樣品分別加入20.0、40.0 、60.0 μmol/L葡萄糖，其測定值表達為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，測得傳感器的回收率為98.5%～106%，表明所制備的酶傳感器具有較好的準(zhǔn)確性，在臨床測定人血清樣品中的葡萄糖方面具有較好應(yīng)用潛力。

表2 稀釋的血清樣品中葡萄糖的回收率Table 2 Recovery of glucose in diluted serum sample

*average of three determination

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，羧基功能化的PFBT-COOH聚合物點在無外加共反應(yīng)試劑及除去溶解氧的條件下，具有強的ECL發(fā)射，且H2O2對其ECL信號具有高效的猝滅作用?；诿复俜磻?yīng)原位生成的H2O2對PFBT-COOH的ECL信號的猝滅作用，建立了對葡萄糖的高靈敏檢測方法。PFBT-COOH與猝滅劑H2O2的結(jié)合為ECL酶傳感器的構(gòu)建提供了理想的平臺。