霍志銘，何汶懿，王 婕，夏 凌，肖小華，李攻科

(中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

檸檬酸是一種重要的有機酸，對大部分需氧細胞而言，檸檬酸是檸檬酸循環(huán)(Krebs循環(huán))中的重要代謝物[1]。Giske?degad?rd等[2]的研究表明，惡性前列腺癌組織中檸檬酸含量較良性組織低，檸檬酸可作為前列腺癌的生物標(biāo)志物(Biomarker)之一，其在組織中的濃度可用于評估前列腺癌的等級。尿液中的檸檬酸含量可用來鑒別診斷腎結(jié)石[3]和腎小管酸中毒，在骨骼疾病診斷中也發(fā)揮著重要作用[4]。檸檬酸的分析方法主要有氣相色譜(GC)法[5]、高效液相色譜(HPLC)法[6]、毛細管電泳法[7]和穩(wěn)定同位素比值法[8]等。但這些方法存在耗時、操作復(fù)雜和儀器設(shè)備昂貴[9]等不足，發(fā)展新型、快速、準(zhǔn)確、可視化定量檢測檸檬酸的方法具有重要意義。

螺吡喃(Spiropyran,SP)[10]是目前研究廣泛的有機光致變色材料之一，其分子由互相垂直的吲哚啉和苯并吡喃兩部分通過螺碳結(jié)合，有螺吡喃和部花菁(Merocyanine,MC)兩種形態(tài)。無色的SP態(tài)螺吡喃在紫外光激發(fā)下，分子的螺碳與相鄰氧原子的C—O鍵發(fā)生斷裂，開環(huán)異構(gòu)化為有色的MC態(tài)。MC態(tài)螺吡喃在可見光或熱激發(fā)下，分子重新閉環(huán)，變回?zé)o色的SP態(tài)[11]。SP態(tài)螺吡喃的吸收光譜表現(xiàn)出兩個峰，在272 nm處和351 nm處分別為吲哚啉和苯并吡喃的π-π*電子躍遷；而MC態(tài)螺吡喃由于部花菁的共軛結(jié)構(gòu)，在568 nm的可見光處有明顯吸收峰出現(xiàn)[12]。螺吡喃作為分子探針在分析化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如用于金屬離子[13-14]、親核性陰離子[15]和氨基酸[16]等的檢測。

開環(huán)態(tài)螺吡喃的螺碳位為三級碳正離子，受親核試劑的進攻易發(fā)生加成反應(yīng)[12]。因此，親核性的檸檬酸可作為螺吡喃的目標(biāo)物并與之進行特異性結(jié)合。此外，生物樣品中螺吡喃探針的水溶性及其與樣品的結(jié)合作用強度是影響探針實際應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。針對這些問題，本文采用羥基吡啶基團對傳統(tǒng)螺吡喃探針進行功能化，實現(xiàn)了探針?biāo)苄约皩δ繕?biāo)檸檬酸響應(yīng)能力的共同提高。通過引入羥基吡啶基團，增強了螺吡喃與水的氫鍵作用及探針的水溶性。此外，檸檬酸與羥基吡啶基團的螯合作用及對探針螺碳正離子的親核加成作用，協(xié)同提高了探針的響應(yīng)能力，據(jù)此建立了尿樣中檸檬酸的熒光檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀及Bruker AVANCE 400 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司);UV-2600紫外可見分光光度計、RF-5301PC熒光分光光度計和LCMS-8050三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本Shimadzu公司)。

2,3,3-三甲基吲哚、5-硝基水楊醛、3-羥基吡啶、KOH(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；NaOH、Na2SO4、醋酸、濃鹽酸、NaCl、檸檬酸、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、乙醇、四氫呋喃、CHCl3、丙酮、甲醇、CH2Cl2(廣州化學(xué)試劑廠)；MnO2(活化)、氘代氯仿、氘代二甲基亞砜(北京百靈威科技有限公司)；碘甲烷(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；哌啶(永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司)；SnCl2·2H2O(上海麥克林生化科技有限公司)；甲醛水溶液(西隴科學(xué)股份有限公司)。以上試劑均為分析純。99.5%人工尿液(廣州學(xué)友生物科技有限公司)。

1.2 羥基吡啶功能化螺吡喃探針合成路線

羥基吡啶功能化螺吡喃(Hydroxypyridine functionalized spiropyran，HFS)探針1A的合成路線如圖1所示。根據(jù)文獻[11]制備化合物1b；化合物1b與5-硝基水楊醛反應(yīng)得到化合物1c。用SnCl2·2H2O作為還原劑將1c氨基化制備中間物2c。另一方面，將3-羥基吡啶與甲醛經(jīng)過一系列反應(yīng)后得到另一中間物2d[17-18]?；衔?c和2d在常溫下反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物HFS探針1A[11]?；衔?f按文獻[19]合成。采用1H NMR、13C NMR和質(zhì)譜表征化合物1c、1A和1f。

化合物1c：1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ8.02(d,J=8.6 Hz,2H),7.21(d,J=1.3 Hz,1H),7.10(dd,J=7.2,1.2 Hz,1H),6.93(d,J=10.4 Hz,1H),6.89(td,J=7.4,0.9 Hz,1H),6.77(d,J=8.5 Hz,1H),6.57(d,J=7.7 Hz,1H),5.87(d,J=10.3 Hz,1H),2.75(s,3H),1.30(s,3H),1.20(s,3H)。

化合物1A：1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ13.30(d,J=44.3 Hz,1H),8.83(s,1H),8.31 ～8.16(m,1H),7.33(dd,J=8.4,1.4 Hz,1H),7.19(t,J=2.1 Hz,1H),7.18 ～7.15(m,1H),7.13(d,J=2.7 Hz,1H),7.09(dd,J=7.4,1.2 Hz,1H),6.94 ～6.83(m,2H),6.78(d,J=8.6 Hz,1H),6.55(d,J=7.7 Hz,1H),5.78(d,J=10.2 Hz,1H),2.76(d,J=2.0 Hz,3H),1.34(d,J=2.3 Hz,3H),1.19(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ160.87,158.12,154.55,148.08,141.19,139.67,137.62,136.58,128.99,127.69,126.19,124.72,122.81,121.54,120.66,119.80,119.32,115.99,106.90,104.85,60.41,51.95,28.96,25.91,20.16。MS:M=396.2m/z,理論Mt=397.5m/z。

化合物1f：1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ12.20(s,1H),8.19(d,J=2.8 Hz,1H),7.98(dd,J=9.0,2.8 Hz,1H),7.19(d,J=10.4 Hz,1H),7.11(t,J=7.5 Hz,2H),6.84(d,J=9.0 Hz,1H),6.78(t,J=7.4 Hz,1H),6.64(d,J=7.8 Hz,1H),5.98(d,J=10.4 Hz,1H),3.42-3.22(m,4H),1.17(s,3H),1.06(s,3H)。

圖1 HFS探針1A以及參比探針1c、1f的合成路線Fig.1 Synthesis route of HFS probe 1A and reference probes 1c and 1f

1.3 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A的光譜測定

測定40 μmol/L HFS探針1A乙腈-水溶液(1∶1，體積比)的紫外可見吸收光譜及熒光光譜，光譜測定過程中采用365 nm 3 W外置光源對溶液進行激發(fā)。此外，將40 μmol/L HFS探針1A的乙腈溶液與2 000 μmol/L檸檬酸水溶液以1∶1(體積比)比例混合，在35 ℃下超聲反應(yīng)3 min。反應(yīng)結(jié)束后對溶液進行紫外可見吸收光譜及熒光光譜測定。其中熒光光譜測定條件：激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為380 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

1.4 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A的抗干擾實驗

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

分別將濃度為20.0、30.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 μmol/L的檸檬酸水溶液與80 μmol/L HFS探針1A的乙腈溶液以1∶1(體積比)比例混合，于35 ℃下超聲反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后測定溶液在280 nm紫外激發(fā)下于380 nm波長處的熒光強度。

1.6 人工尿液中檸檬酸回收率的測定

配制分別含有40.0、50.0、60.0 μmol/L的檸檬酸的水-人工尿液混合溶液，其中人工尿液占2.5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)。分別將該檸檬酸水溶液與80 μmol/L HFS探針1A的乙腈溶液以1∶1(體積比)比例混合，于35 ℃水浴中超聲反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后測定溶液在280 nm紫外激發(fā)下于380 nm波長處的熒光強度，并計算檸檬酸回收率。

1.7 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A與檸檬酸反應(yīng)的 Job's plot曲線

在室溫下，將不同濃度的HFS探針1A的乙腈溶液與檸檬酸水溶液按1∶1(體積比)比例混合，反應(yīng)至平衡后測定380 nm處的熒光強度。實驗中HFS探針1A及檸檬酸的總濃度維持在80 μmol/L。

1.8 3種螺吡喃探針與檸檬酸結(jié)合能力對比實驗

分別在40 μmol/L參比探針1c、1f和HFS探針1A的乙腈溶液中加入2 000 μmol/L的檸檬酸水溶液(1∶1，體積比)，25 ℃下反應(yīng)20 min，對比溶液變色情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A的結(jié)構(gòu)表征

按HFS探針1A的原子編號(圖2A)，通過核磁共振譜圖并結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)對其進行結(jié)構(gòu)表征。

圖2 HFS探針1A的結(jié)構(gòu)及原子編號(A)、核磁共振氫譜(B)、核磁共振碳譜(C)圖及質(zhì)譜(D)Fig.2 Structural sketch with atomic number(A),1H NMR(B),13C NMR(C) and MS(D) of HFS probe 1A the corresponding atoms of HFS probe 1A are labeled in the 1H NMR and 13C NMR spectra(核磁氫譜及碳譜上對HFS探針1A原子的化學(xué)位移依編號作了歸屬)

從圖2B可知，編號10～12的3個甲基(1.2、1.3、2.8 ppm)及編號為16、17兩個烯基(5.8、7.1 ppm)是螺吡喃骨架的特征峰，而編號30的酚基(13.4 ppm)、編號23的亞氨基(8.8 ppm)及編號28的吡啶基N-鄰位H(8.2 ppm)則是羥基吡啶功能團的特征基團。圖2C的核磁碳譜提供了相似的證明結(jié)果，從圖中能清晰區(qū)分不同碳原子的歸屬。結(jié)合質(zhì)譜的分子離子峰數(shù)據(jù)M=396.2m/z(理論Mt=397.5m/z，圖2D)，可證明HFS探針1A的結(jié)構(gòu)如圖2A所屬。

2.2 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A光致變色性能研究

HFS探針1A的溶液在365 nm紫外照射下可發(fā)生由無色變成黃色(圖3A)的現(xiàn)象。其380 nm處的吸收峰強度大幅下降，并在480 nm處出現(xiàn)新的吸收峰。顯然，HFS探針1A在紫外光激發(fā)下發(fā)生了異構(gòu)化開環(huán)，由SP態(tài)轉(zhuǎn)變成MC態(tài)。MC態(tài)下的HFS探針1A分子呈平面大共軛結(jié)構(gòu)，與SP態(tài)結(jié)構(gòu)相比能級差降低，吸收峰紅移，因此在低頻區(qū)產(chǎn)生新吸收峰。除變色以外，經(jīng)紫外照射開環(huán)化的HFS探針1A的熒光光譜也發(fā)生了相應(yīng)的變化(圖3B)，其380 nm處的特征熒光峰發(fā)生了15 nm的紅移。綜上所述，HFS探針1A具有光致異構(gòu)化的性能，可在紫外光下發(fā)生顏色及熒光特性的改變。利用該特性作可視化指示信號，能有效構(gòu)建基于異構(gòu)化響應(yīng)的檢測方法。

考察了HFS探針1A對檸檬酸的響應(yīng)能力。結(jié)果表明，加入檸檬酸后HFS探針1A溶液從無色變?yōu)榧t色，在480 nm處出現(xiàn)新吸收峰(圖3C)。除變色外，體系還發(fā)生了明顯的熒光猝滅現(xiàn)象(圖3D)，380 nm處的特征熒光峰基本消失。因此，基于HFS探針1A對檸檬酸響應(yīng)前后的變色及熒光改變特性，可構(gòu)建對檸檬酸的檢測方法。

2.3 檸檬酸測定條件優(yōu)化

研究了HFS探針1A測定檸檬酸的最佳反應(yīng)溫度、光激發(fā)條件和pH值。圖4A表明，HFS探針1A對20 μmol/L檸檬酸的熒光變化受溫度影響較小，不同溫度下反應(yīng)60 min的各組熒光相對猝滅值ΔIF380nm穩(wěn)定在180～202.6之間。綜合考慮操作難度及性能，選擇恒溫水浴35 ℃下反應(yīng)60 min。從圖4A還可得知，同溫度下HFS探針1A溶液與檸檬酸的反應(yīng)無需紫外光激發(fā)，說明HFS探針1A對檸檬酸有較強的結(jié)合及響應(yīng)能力。HFS探針1A在不同pH值環(huán)境下與1 000 μmol/L檸檬酸反應(yīng)前后的熒光強度及熒光猝滅比例如圖4B所示，由圖可見，pH≤6.0下響應(yīng)不明顯，溶液的熒光無顯著變化；pH 7.0時，HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)后相對熒光猝滅值達到最大(0.91)。該熒光猝滅響應(yīng)是檸檬酸根離子與HFS探針MC態(tài)螺碳(8號位，圖2A)的親核加成及與羥基吡啶螯合協(xié)同作用的結(jié)果。值得注意的是，酸性條件下HFS探針1A的MC態(tài)更穩(wěn)定，而檸檬酸根則相反；從實驗可知，pH 7.0是兩者達到平衡的最佳pH值。因此，HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)的最佳條件為pH 7.0且無需紫外照射，恒溫水浴35 ℃下反應(yīng)60 min。

圖3 HFS探針1A溶液(40 μmol/L)經(jīng)365 nm紫外光激發(fā)前后的紫外-可見吸收光譜(A)和熒光光譜(B)以及加入2 000 μmol/L檸檬酸前后的紫外-可見吸收光譜(C)和熒光光譜(D)Fig.3 UV-visible absorption spectra(A) and fluorescence spectra(B) of HFS probe 1A solution(40 μmol/L) before and after being excited by 365 nm ultraviolet light,and UV-visible absorption spectra(C) and fluorescence spectra(D) before and after adding citric acid(2 000 μmol/L)insert C:color changes of HFS probe 1A solution before and after adding citric acid

2.4 干擾實驗

2.5 人工尿樣中檸檬酸含量的檢測

在最佳反應(yīng)條件下，HFS探針1A對檸檬酸有靈敏的響應(yīng)特性，且伴隨著顏色和熒光強度的變化。其中熒光的猝滅特征最為明顯，可用于高靈敏的定量分析。據(jù)此建立了HFS探針1A對2.5%人工尿液中檸檬酸的熒光檢測方法。以380 nm處的熒光猝滅峰為定量依據(jù)，HFS探針1A對檸檬酸的響應(yīng)在20～120 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.524+0.193lgx，相關(guān)系數(shù)r2=0.992 9，其中，x=lg[citric acid](μmol/L)；y=(IF0-IF)/IF0，IF0和IF分別為與檸檬酸反應(yīng)前后樣品的發(fā)射光強度。此外，利用3倍空白值平均偏差與曲線斜率的比值可得檢出限為1.0 μmol/L。基于該條件進行了40.0、50.0、60.0 μmol/L的加標(biāo)人工尿液中檸檬酸含量的測定，回收率為85.7%～92.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～9.2%(表1)。該方法滿足人工尿液中檸檬酸的定量檢測要求，且HFS探針1A具有定量檢測尿液中檸檬酸的潛力。

圖4 HFS探針1A的溫度及光照條件(A)， pH值優(yōu)化(B)及抗干擾實驗(C)Fig.4 Optimalization of temperature and UV irradiation(A),pH value(B) and selectivity experiment for HFS probe 1A before and after adding citric acid(C)IFC:fluorescence intensity at 380 nm after addition of citric acid in the blank samples;ccitric acid(A-B):20,1 000 μmol/L;cHFS probe 1A(C):20 μmol/L

2.6 羥基吡啶功能化螺吡喃探針1A對檸檬酸的響應(yīng)特性及機理探討

表1 人工尿樣中檸檬酸含量測定的回收率實驗Table 1 Spiked recovery of citric acid in artificial urine(n=3)

HFS探針1A溶液在480 nm處吸收峰的強度隨檸檬酸(CA)濃度的增加而升高(圖5A)，這是因為HFS探針1A的螺碳(8號位，圖2A)在親核型檸檬酸根的進攻下，自發(fā)開環(huán)成MC態(tài)并與檸檬酸根離子作用形成1A-CA復(fù)合物[11]。這也解釋了HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)后發(fā)生的熒光猝滅現(xiàn)象： HFS探針1A結(jié)合前的SP態(tài)在紫外激發(fā)下能發(fā)出較強熒光，而結(jié)合后1A-CA復(fù)合物的熒光強度較弱，宏觀上表現(xiàn)為加入檸檬酸后其熒光發(fā)生猝滅。

圖5 HFS探針1A與不同濃度檸檬酸反應(yīng)的紫外-可見吸收光譜圖(A)、Job's plot曲線(B)及3種不同結(jié)構(gòu)的螺吡喃化合物對檸檬酸的響應(yīng)對比圖(C)Fig.5 UV-visible absorption spectra of HFS probe 1A with different concentrations citric acid(A),Job's curve(B) and probe of 1c,1A and 1f before and after adding citric acid(C)

為了進一步考察HFS探針1A與檸檬酸的反應(yīng)比例，繪制了HFS探針1A與檸檬酸反應(yīng)的Job's plot曲線。將HFS探針1A溶液與檸檬酸在室溫下反應(yīng)至平衡，測定其在380 nm處的熒光強度。由圖5B可見，加入檸檬酸前，[1A]/([1A]+[citric acid])= 1.0，溶液熒光最強；隨著檸檬酸比例增加，該數(shù)值減小，HFS探針1A的熒光強度呈線性下降，當(dāng)[1A]/([1A]+[citric acid])=0.57時達到拐點；而[1A]/([1A]+[citric acid])<0.57時，熒光強度降低的曲線斜率明顯減小。實驗所得兩條Job's plot擬合曲線交點在[1A]/([1A]+[citric acid])=0.57處，即HFS探針1A與檸檬酸的反應(yīng)比例約3∶2。

從HFS探針1A與檸檬酸形成復(fù)合物1A-CA的角度分析，HFS探針1A存在兩個與檸檬酸作用的位點，分別是8號缺電子螺碳及30號吡啶的羥基；而一個富電子檸檬酸根離子上有3個可與HFS探針1A相互作用的羧基。由此可見，通過3分子HFS探針1A與2分子富電子檸檬酸根結(jié)合(圖5C)，可有效促使HFS探針1A從SP態(tài)向MC態(tài)的轉(zhuǎn)變并形成穩(wěn)定的復(fù)合物1A-CA。為進一步證實該結(jié)論，制備了兩種與HFS探針1A結(jié)構(gòu)相似的螺吡喃探針1c和1f，并在相同反應(yīng)條件下對比了3種探針與檸檬酸的反應(yīng)現(xiàn)象。如圖5C所示，當(dāng)40 μmol/L的1c、1f和HFS探針1A分別與2 000 μmol/L的檸檬酸混合加熱后，1c和1f由于與檸檬酸根的離子結(jié)合能力不足，反應(yīng)前后溶液顏色基本無變化；而HFS探針1A溶液的顏色發(fā)生明顯變化。因此，羥基螯合與螺碳親核加成的協(xié)同作用是促進HFS探針1A對檸檬酸根選擇性響應(yīng)的主要原因。

3 結(jié) 論

本文制備了具有良好水溶性的HFS探針1A，該探針對檸檬酸根離子有高選擇性響應(yīng)，并伴隨著明顯的顏色變化和熒光猝滅?；诖藱C制建立了人工尿樣中檸檬酸含量的分析方法，方法線性范圍為20～120 μmol/L，檢出限為1.0 μmol/L；在2.5%人工尿液中檸檬酸的回收率為85.7%～92.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差介于3.0%～9.2%之間。此外，深入探討了HFS探針1A與檸檬酸的作用機制，發(fā)現(xiàn)其高選擇性源于探針螺碳的親核結(jié)合力和羥基螯合作用力的協(xié)同作用。HFS探針1A在尿樣中檸檬酸的可視化檢測中具有良好的應(yīng)用潛力。