廖承悅，彭 伙，高則航，齊 同，周洪波*，趙建龍*

(1.中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點實驗室,上海 200050;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.上?？萍即髮W(xué),上海 201210)

數(shù)字PCR是一種高靈敏度的核酸定量檢測方法[1],它將起始待測模板分散到大量的微反應(yīng)器中,每個反應(yīng)器包含至少一個或多個拷貝的目標(biāo)DNA模板,模板在微反應(yīng)器中進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)后，對陰性(未包含模板)陽性(包含模板)反應(yīng)器的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計并算出它們相應(yīng)的比例,含有目標(biāo)DNA分子的微反應(yīng)器數(shù)量滿足泊松分布。根據(jù)泊松分布公式即可算出目標(biāo)DNA分子的初始拷貝數(shù)[2]。數(shù)字PCR技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于疾病早期檢測診斷和微生物檢測分析等[3-4]。

常規(guī)的實驗室檢測PCR擴增反應(yīng)后的陰性陽性反應(yīng)器比例的技術(shù)為激光誘導(dǎo)熒光法[5]，熒光法在PCR反應(yīng)過程中需要添加熒光探針進(jìn)行標(biāo)記，在終端檢測過程中需要昂貴復(fù)雜的光學(xué)設(shè)備，難以實現(xiàn)小型化、集成化。相比之下，由于DNA大分子有較好的導(dǎo)電性[6]，電化學(xué)檢測以PCR擴增產(chǎn)物為敏感對象，將DNA擴增帶來的電導(dǎo)變化通過電極轉(zhuǎn)換為特征檢測信號[7]，具有靈敏度高、成本低、易于集成化和微型化等優(yōu)點[8]。本文研究目標(biāo)是通過電化學(xué)檢測的手段實現(xiàn)PCR擴增反應(yīng)后陰性陽性反應(yīng)器比例的檢測。

近年來，得益于液滴微流控系統(tǒng)高通量、低樣品量、高靈敏度的特點[9-10]，將微液滴作為載體與電化學(xué)檢測相結(jié)合成為受研究者青睞的無標(biāo)記檢測手段[11-12]。Sohn等[13]設(shè)計了電容式細(xì)胞計數(shù)器，相比于捕獲式的檢測陣列提高了檢測通量，但接觸式的電極導(dǎo)致芯片在工作一定時間后會出現(xiàn)電極極化與污染的現(xiàn)象，芯片使用壽命短。Kemna等[14]通過檢測空液滴與封裝了細(xì)胞的液滴之間的阻抗差異，實現(xiàn)了無需標(biāo)記物的細(xì)胞包裹率的檢測，然而雙電極系統(tǒng)的檢測信號中混有背景信號，加大了信號處理的難度。De Ninno等[15]采用電極陣列結(jié)構(gòu)，排除了液滴在通道中位置帶來的誤差影響，但芯片制造工藝復(fù)雜，電極與微流控芯片之間需要高精度的對準(zhǔn)鍵合，芯片成品率低。Saateh等[16]使用共面三電極結(jié)構(gòu)，抑制了背景漂移，實現(xiàn)了液滴合成的單分散性實時監(jiān)測，但由于共面電極結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的是非均勻電場[17]，電流密度分布不均使得檢測區(qū)對于液滴形貌與通道參數(shù)過于敏感，影響檢測重復(fù)性。因此，檢測芯片的復(fù)用性、靈敏度、成品率、重復(fù)性極為關(guān)鍵。

本文設(shè)計了基于非接觸式電導(dǎo)檢測的數(shù)字PCR檢測芯片，避免了與介質(zhì)直接接觸，提高了芯片復(fù)用性。三電極體系實現(xiàn)了信號的差分檢測，消去了噪聲信號，降低了檢測電路的復(fù)雜度。而本文采用平行3D電極結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)均勻電場分布[18]，可降低微通道參數(shù)與液滴形貌帶來的誤差，提高檢測穩(wěn)定性。熔融態(tài)鉍合金注入結(jié)合軟光刻工藝，電極通道與微流控通道自對準(zhǔn)一體化成型，芯片成品率高、設(shè)計參數(shù)易調(diào)整。最終，實現(xiàn)了PCR反應(yīng)后陰性陽性液滴的電信號比對，無需熒光探針標(biāo)記，通量可達(dá)100個/秒。在DNA模板物濃度為0.5×104～3×104copies/μL的區(qū)間內(nèi)與熒光強度具有良好的相關(guān)性。

1 實驗部分

1.1 材料與設(shè)備

聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS，分析純，美國DowCorning公司)；三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷(純度97%)、礦物油(生物技術(shù)級)、表面活性劑TritonX-100(分析純)，均購自美國Sigma Aldrich公司；光刻膠SU-8(美國Microchem公司)；DEPC水(Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯，純度99.995%，上海生工生物工程公司)；2×Light Cycler?480 Probe Master(瑞士Roche公司)；合成設(shè)計的各種引物和探針(上海占標(biāo)生物科技公司);EGFR(Epidermal growth factorreceptor，表皮生長因子受體)基因 19 號外顯子突變型的 pGEM 質(zhì)粒(中國科學(xué)院細(xì)胞庫肺癌細(xì)胞株)；低熔點鉍合金(撫順佳邦有色金屬公司)；實驗用水均為去離子水。

DP80型CCD圖像傳感器(日本Olympus公司) 用于觀測液滴生成情況;DSO-X2004A示波器(美國Agilent公司)用于信號采集與觀測；E3631A開關(guān)電源(美國Agilent公司)用做電路電源供給；DG4162信號發(fā)生器(美國Rigol公司)用于產(chǎn)生交流激勵信號；Cond3210電導(dǎo)率儀(德國WTW公司)。

1.2 芯片設(shè)計與制備

微流控芯片的整體設(shè)計如圖1所示，灰色部分為微流控通道，金色部分為電極，1、3為連續(xù)相(礦物油)入口，2為樣品注入口，4、5、6用于低熔點鉍合金注入，7為收集口。結(jié)構(gòu)A為流動聚焦型結(jié)構(gòu)，用于微液滴合成;結(jié)構(gòu)B為電極與微通道耦合區(qū)，用于微液滴的流式電信號檢測，其中a、b為激勵電極，c為感應(yīng)電極，d為PDMS絕緣層，e為主通道。整個芯片高度為40 μm，主通道寬度150 μm，單個激勵電極有效檢測寬度150 μm，感應(yīng)電極寬度380 μm，PDMS絕緣層5 μm左右。芯片用水沖洗干凈后可重復(fù)使用。

以單晶硅片為襯底，利用硫酸溶液清洗硅片的表面，水清洗后，在 200 ℃熱板上烘5 min使硅片脫水，之后以2 000 rpm 的轉(zhuǎn)速甩涂SU-8 30 s，常溫下靜置60 min，在熱板上先 65 ℃烘3 min，然后95 ℃烘5 min，在光刻機上進(jìn)行曝光，曝光時間為50 s，曝光后微芯片結(jié)構(gòu)將轉(zhuǎn)移至 SU-8光刻膠上，將硅片放入烘箱內(nèi)先于65 ℃烘 1 min，再于95 ℃烘 3 min，并進(jìn)行緩慢降溫以減少模具裂紋，顯影與硬烘后得到凸型模具。將PDMS預(yù)聚體與固化劑按10∶1 比例混合，真空脫氣后，澆鑄到SU-8模板上，固化后，將PDMS從硅片上揭下與玻璃片一同進(jìn)行等離子體處理，鍵合形成PDMS芯片。最后將熔點為60 ℃的低熔點鉍合金在80 ℃真空烘箱中加熱30 min，使熔融態(tài)的鉍合金被吸入電極微通道，完成帶有電極的微流控芯片制備。相比于傳統(tǒng)的檢測電極與微流控芯片獨立制作再進(jìn)行對準(zhǔn)鍵合的工藝流程，本研究的檢測電極與微流控芯片一體化成型，無需高精度的對準(zhǔn)鍵合。

圖1 芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of chip structureA:flow-focusing structure(流動聚焦型結(jié)構(gòu)),B:structure of detection area(檢測區(qū)結(jié)構(gòu))

1.3 PCR反應(yīng)液滴的制備

本實驗使用10 μL體系，包含5 μL 2× Light Cycler?480 Probe Master、0.4 μL上游引物和0.4 μL下游引物、0.3 μL MGB(Minor groove binder，小溝結(jié)合)探針、0.3 μL UNG(Uracil-N-glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶)水解酶(Takara)、1 μL DNA模板(EGFR 基因19號外顯子突變型的pGEM質(zhì)粒)，最后補入2.6 μL DEPC水。

通入微流控芯片生成微液滴，并收集轉(zhuǎn)移至離心管中，在PCR原位儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到混有陽性與陰性的PCR液滴。這些液滴將會導(dǎo)入PCR液滴檢測芯片中以測試芯片性能。

圖2 檢測系統(tǒng)的示意圖Fig.2 Schematic of the detection system setup

1.4 檢測平臺的搭建

為測試芯片性能，搭建了電學(xué)檢測系統(tǒng)(如圖2)。整個系統(tǒng)包括微流控芯片、信號發(fā)生器、信號放大電路(I-V 轉(zhuǎn)換器與二級放大電路)、注射泵、示波器、顯微鏡和計算機控制系統(tǒng)。信號發(fā)生器(DG4162)輸出幅度相等，相位相差180°的兩路正弦激勵信號到微流控芯片的激勵電極，檢測信號通過自行搭建的信號放大電路(OPA129運算放大器)放大后，由示波器(DSO-X 2004A)進(jìn)行采集并輸出到上位機，信號處理由本課題組編寫的Matlab程序?qū)崿F(xiàn)。微流控芯片與板級電路均置于外殼接地的鑄鋁材質(zhì)屏蔽盒中以屏蔽電磁干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極結(jié)構(gòu)的模擬仿真

為了探究電極的信號響應(yīng)情況，本文利用COMSOL Multiphysics軟件中的靜電學(xué)模塊進(jìn)行有限元仿真。礦物油(σ=1×10-14S/m,εr=2.5) 為連續(xù)相，水(σ=5×10-5S/m,εr=80)液滴直徑140 μm，以5 μm厚度的PDMS(σ=1×10-14S/m,εr=2.8)作為絕緣層，對檢測區(qū)(圖1結(jié)構(gòu)B)電場分布與電流密度進(jìn)行模擬，圖3(A～D)中E1、E2為激勵電極，E3為感應(yīng)電極，分布線為電場線，紅色箭頭為電場方向，電流方向與電場方向一致。對E1、E2施加幅值相等，相位相差180°的正弦激勵電壓，主要有以下3種不同情況:①檢測區(qū)只有連續(xù)相(圖3A)，此時E1與E3，E2與E3之間阻抗相等，產(chǎn)生的交變電流互相抵消；②當(dāng)液滴經(jīng)過檢測區(qū)，在激勵電極與感應(yīng)電極之間時(圖3B)，兩個激勵電極與感應(yīng)電極之間的阻抗不再一致，產(chǎn)生了差分電流；③微液滴在檢測區(qū)域中心(圖3C)，電極間阻抗再次相等，此時無差分電流產(chǎn)生。平面電極結(jié)構(gòu)(圖3D)電場分布集中在電極附近，在電流密度較高的區(qū)域內(nèi)液滴形貌或位置的微小改變也將引起輸出信號的抖動，而本芯片采用的平行3D電極結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的電場分布均勻，有效降低了檢測區(qū)內(nèi)通道高度與液滴形貌帶來的誤差。

對檢測區(qū)建立等效電路模型如圖3E所示，其中Cpex為激勵電極間寄生電容，Cw為絕緣層壁電容，Cdl為油相與液相之間的雙電層電容，Cp為激勵電極與感應(yīng)電極間電容，Cm為連續(xù)相電容，Rm為連續(xù)相電阻，Ci為分散相電容，Ri為分散相電阻。

激勵電極與感應(yīng)電極間阻抗值主要由電阻值與容抗組成，當(dāng)有液滴處在檢測區(qū)時，阻抗Zd1為：

(1)

圖3 檢測區(qū)的電路模型Fig.3 Model of detection areaA:no droplet(無液滴),B:the droplet passes through the detection area(液滴經(jīng)過檢測區(qū)),C:the droplet in the center of the detection area(液滴在檢測區(qū)域中心位置),D:electric field distribution of planar electrode(平面電極電場分布),E:three-electrode system circuit model(三電極系統(tǒng)電路模型),F:two-electrode system circuit model(雙電極系統(tǒng)電路模型),G:impedance simulation of detection area(檢測區(qū)阻抗仿真)

式中，ω=2πf為激勵信號角頻率，f為激勵信號頻率，R為液滴阻抗值，主要由Ci與Ri決定，Ri與液滴電導(dǎo)率性質(zhì)有關(guān)。當(dāng)無液滴處在檢測區(qū)時，由于油相的電導(dǎo)率極低，Cm起主導(dǎo)作用，阻抗Zd2定義為：

(2)

兩個激勵電極與感應(yīng)電極間差分電流ΔI可定義為：

(3)

式中，U為交流激勵信號，|Zd1|、|Zd2|分別為Zd1、Zd2的模。由(1)、(2)、(3)式可知三電極體系相比于雙電極系統(tǒng)(圖3F)，排除了Cp、Cpex帶來的不利影響，抑制了連續(xù)相帶來的背景噪聲干擾，提高了檢測精度。電容的定義式為：

(4)

式中，εr為介質(zhì)的相對介電常數(shù)，ε0=8.85×10-12F/m，S與d分別為有效面積與等效厚度，由(4)式可知，降低絕緣層厚度與提高液滴在檢測區(qū)體積分?jǐn)?shù)均能提高信號強度，但在芯片制作過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)絕緣層厚度低于5 μm時，在負(fù)壓灌注熔融態(tài)金屬的狀態(tài)下，容易發(fā)生金屬滲漏到檢測區(qū)的情況，因此，將絕緣層厚度設(shè)計為5 μm。

Cw的理論值為28 fF，這使得系統(tǒng)在低頻率時,受絕緣層壁電容與雙電層電容的影響，檢測回路的阻抗值很高，差分電流難以檢測，需選擇適宜的檢測頻段使得系統(tǒng)阻抗降至可檢測區(qū)間。本文使用的放大電路能對100 fA以上電流產(chǎn)生響應(yīng)，對有液滴時的電極間阻抗進(jìn)行有限元仿真(圖3G所示)，當(dāng)頻率達(dá)到50 kHz時，阻抗將下降至200 MΩ左右。此時只需采用合適的激勵電壓，差分電流可達(dá)nA級別。

圖4 放大電路對不同振幅和頻率的激勵的響應(yīng)Fig.4 Amplifier circuit response to excitations of different amplitudes and frequencies

2.2 檢測條件的優(yōu)化

傳感器的響應(yīng)特性除了依賴于交流激勵信號的頻率和振幅之外，還與電路中元件的頻率特性有關(guān)。所設(shè)計的信號放大電路的轉(zhuǎn)換比為10 nA/80 mV，信號發(fā)生器(DG4162)生成幅值在0.4～2.8 V區(qū)間內(nèi)的正弦信號，該信號通過40 MΩ定值電阻產(chǎn)生10～70 nA內(nèi)的交變電流，得到放大電路對不同大小的交變電流的幅頻響應(yīng)曲線。如圖4所示，超過100 kHz后增益開始下降，為準(zhǔn)確反映待測信號，選取激勵信號頻率為80 kHz。

2.3 微液滴的檢測

微液滴在生成過程中受壓強、流量等因素的影響不完全均一，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之比)一般在3%以內(nèi)。本文探究了液滴尺寸變化對電信號的影響。采用20 Vpp，頻率為80 kHz的激勵信號對不同尺寸的水液滴進(jìn)行電信號檢測，結(jié)果如圖5A示，圖5B為其信號原始圖像，每2個峰代表1個液滴經(jīng)過，經(jīng)Matlab提取信號包絡(luò)線得到圖5C，峰值在液滴中心線與激勵電極中心線重合時產(chǎn)生。當(dāng)液滴長度(L)為180 μm時，液滴形狀變?yōu)槟z囊型。如圖5D所示，Ld為液滴長度，Le為兩個激勵電極中心線之間的間距。此時液滴體積為1 nL，輸出的電壓信號峰值不再明顯變化，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響極小。芯片的檢測通量與液滴速度密切相關(guān)，液滴速度計算式為：

(5)

(6)

式中，v為液滴流速，f為激勵信號頻率，fs為數(shù)據(jù)采樣頻率。DSO-X 2004A示波器采樣頻率最高可達(dá)2 GSa/s，可以保證采集到的檢測信號不失真。

通過文獻(xiàn)調(diào)研[20]，極低濃度的DNA溶液電導(dǎo)率由溶劑決定，隨著DNA濃度的增加，溶液的電導(dǎo)率將迅速增加，區(qū)分PCR陰性陽性液滴的關(guān)鍵在于高濃度的DNA擴增產(chǎn)物提高了電導(dǎo)率。初始狀態(tài)下，液滴電導(dǎo)率由緩沖液電導(dǎo)率決定，液滴中極微量的DNA模板無法對液滴電導(dǎo)率造成影響。通過PCR擴增后，未包含DNA模板的陰性液滴電導(dǎo)率仍以PCR緩沖液的電導(dǎo)率為主導(dǎo)，而陽性液滴中DNA模板數(shù)相比于初始狀態(tài)增至109以上，高濃度的DNA產(chǎn)物使得陽性液滴電導(dǎo)率遠(yuǎn)大于陰性液滴。推測本實驗中陽性PCR液滴電導(dǎo)率在10 μS/cm以上，陰性液滴電導(dǎo)率在0.5 μS/cm左右。為了測試檢測系統(tǒng)在此范圍內(nèi)對電導(dǎo)率的敏感度，使用Cond3210電導(dǎo)率儀調(diào)配電導(dǎo)率區(qū)間為0.5～40 μS/cm的NaCl溶液，生成長度為180 μm的微液滴進(jìn)行檢測。如圖5F所示，輸出電壓幅值隨著電導(dǎo)率提高而增大，直到電導(dǎo)率升至30 μS/cm，證明了陽性液滴檢測的可行性。

圖5 微液滴尺寸、速度、電導(dǎo)率的檢測Fig.5 Measurement of droplet size,velocity and conductivityA:relationship between droplet length and output voltage(液滴長度與輸出電壓關(guān)系),B:original voltage signal image(原始電壓信號圖像),C:droplet signal envelope(液滴信號包絡(luò)線),D:droplet morphology(液滴形貌),E:laminar flow(層流模式),F:relationship between conductivity and output voltage(電導(dǎo)率與輸出電壓關(guān)系)

2.4 PCR反應(yīng)后陰性陽性液滴的電信號檢測

為了驗證本芯片在PCR液滴檢測方面的性能，首先使用高精度的熒光檢測法對所使用的DNA模板物濃度進(jìn)行定量分析，以該方法的檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，與本文的電導(dǎo)檢測法檢測結(jié)果進(jìn)行比對。

首先對微液滴進(jìn)行熒光檢測，原理是將液滴單層排列后熒光激發(fā)，通過圖像采集與處理得到陰性陽性液滴比例。圖6A為1 nL大小PCR陽性體系的液滴明場圖像，圖6B為其熒光激發(fā)圖像。

圖6 熒光法檢測陰性陽性液滴比例Fig.6 Proportion of negative and positive droplets detected by fluorescence methodA:bright field image(明場圖像),B:fluorescence excitation image(熒光激發(fā)圖像)

根據(jù)泊松分布公式可計算出初始拷貝數(shù)：

(7)

式中，λ為每個反應(yīng)單元中含有的起始DNA分子平均拷貝數(shù)，k為單個反應(yīng)單元中包含的拷貝分子的數(shù)目，P為一定λ條件下，每個反應(yīng)單元中包含k拷貝目標(biāo)分子的概率。

采用本芯片對未經(jīng)PCR反應(yīng)的液滴進(jìn)行檢測，液滴峰值均在400 mV以下。對PCR反應(yīng)后的液滴進(jìn)行檢測，如圖7A所示，可推斷出峰1、2為陰性液滴雙峰，峰3、4為陽性液滴雙峰，陽性液滴峰值大多在500 mV以上。由此可見，DNA擴增產(chǎn)物使得陽性液滴電導(dǎo)上升，從而顯示出比陰性液滴更強的調(diào)幅信號。使用熒光法與本文的非接觸式電導(dǎo)檢測法對不同濃度DNA模板所產(chǎn)生液滴的結(jié)果進(jìn)行對比，取500 mV以上電信號液滴為陽性液滴，如圖7B所示，在0.5×104～3×104copies/μL濃度區(qū)間內(nèi)電導(dǎo)檢測結(jié)果與熒光檢測結(jié)果實現(xiàn)了良好的相關(guān)性(y=0.95x+0.013，r2=0.998)。整個檢測過程無需標(biāo)記物、操作簡便、成本低，且芯片可重復(fù)使用。

圖7 陰性陽性液滴的檢測Fig.7 Detection of negative and positive dropletsA:droplet electrical signal(液滴電信號),B:comparison of electrochemical and fluorescent results(電化學(xué)法與熒光法結(jié)果比對)

3 結(jié) 論

本文搭建了基于非接觸式電導(dǎo)檢測的PCR液滴檢測系統(tǒng)，并用于1 nL以上的PCR液滴的陰性陽性比例檢測，檢測過程中無需標(biāo)記物，與高精度的熒光檢測法的相關(guān)性良好(r2=0.998)，檢測通量最高可達(dá)100個/秒。芯片的一體化制作方案極大降低了工藝難度，提高了芯片成品率，且易與不同的微流控芯片設(shè)計兼容，有小型化、便攜化的潛力。未來可通過進(jìn)一步的微流控通道設(shè)計優(yōu)化與更高靈敏度的外圍電路實現(xiàn)更高通量與精度的PCR液滴檢測。