方科益，陳樹兵，李 雙，王永健，王春芳，曹國洲

(1.寧波海關(guān)技術(shù)中心，寧波315040; 2.寧波中盛產(chǎn)品檢測公司，寧波315040)

隨著社會的進(jìn)步和工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境問題日益嚴(yán)重。一些工業(yè)廢水和生活污水進(jìn)入江河湖海，導(dǎo)致水體的富營養(yǎng)化，使得水體中藻類大量繁殖。海水水域富營養(yǎng)化會形成赤潮，淡水水域富營養(yǎng)化會形成水華，這些現(xiàn)象出現(xiàn)后，藻類會產(chǎn)生大量的藻類毒素積蓄于水中。藻類毒素一般具有劇烈毒性，可通過食物鏈傳遞，進(jìn)入水生動物體內(nèi)，可在濾食性的軟體貝殼類動物、魚類等水產(chǎn)品組織內(nèi)蓄積，人類一旦過量食入，將引起中毒反應(yīng)[1-4]。藍(lán)藻毒素是一種重要的藻類毒素，它包含具有肝毒性的環(huán)肽毒素，例如微囊藻毒素，還包括具有神經(jīng)毒性和細(xì)胞毒性的生物堿毒素，例如柱孢藻毒素，以及脂多糖內(nèi)毒素等。研究表明，肝毒性是微囊藻毒素的主要毒性，該毒素進(jìn)入人體內(nèi)后，專一性的與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸酶結(jié)合，當(dāng)攝入的藻類毒素濃度較低時，具有潛在的肝毒性和癌誘發(fā)活性，當(dāng)攝入的藻類毒素濃度較高時，則會引起急性中毒，嚴(yán)重者導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、壞死、甚至導(dǎo)致死亡。柱孢藻毒素具有細(xì)胞毒性、肝毒性、遺傳毒性和神經(jīng)毒性，且同樣可能致癌[5-10]。

早期對于藍(lán)藻毒素的檢測方法主要有小鼠測試法、酶聯(lián)免疫檢測法等生物學(xué)方法。近年來，高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等分析方法逐漸成為藍(lán)藻毒素的主要檢測方法[11-13]。張維昊等[14]采用高效液相色譜法測定了魚類樣品中微囊藻毒素的含量;行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4319－2015規(guī)定了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中微囊藻毒素的含量。其他種類的藍(lán)藻毒素的檢測方法報道主要集中于水基質(zhì)，關(guān)于水產(chǎn)品基質(zhì)的報道還較少。在食品殘留及污染物篩查技術(shù)研究中，高分辨質(zhì)譜法(HRMS)已得到一定的推廣和應(yīng)用，例如靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)(Orbitrap MS)和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(TOF-MS)等依靠精確質(zhì)量數(shù)(可精確到小數(shù)點第4 位)和保留時間對目標(biāo)物進(jìn)行定性識別[15]。該技術(shù)在水產(chǎn)品中藍(lán)藻毒素的檢測領(lǐng)域應(yīng)用還較少。

本工作選擇柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 作為分析對象，利用Qu ECh ERS技術(shù)作為前處理方法，并通過優(yōu)化最佳技術(shù)參數(shù)，結(jié)合高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HPLC-HRMS)測定水產(chǎn)品中3種藍(lán)藻毒素的含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo Fisher Q-Exactive型高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI);Heldolph Multi Reax型旋渦混合儀;KQ-500DE 型超聲波清洗儀;N-EVAP 型氮吹儀;M2002E型電子天平;Millipore型超純水器。

柱孢毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:30μmol·L－1，介質(zhì)為甲醇。

微囊藻毒素LR 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:20 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

微囊藻毒素RR 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:20 mg·L－1，介質(zhì)為甲醇。

甲醇為高效液相色譜純級;甲酸、甲酸銨、無水硫酸鈉和中性氧化鋁均為分析純;其他試劑均為色譜純;石墨化碳黑(GCB);試驗用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 儀器工作條件

1)Hypersile Gold C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，3μm);流動相A 為含2 mmol甲酸銨的0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液，B為含2 mmol甲酸銨和0.1%甲酸的95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈溶液;流量為0.3 m L·min－1;進(jìn)樣量為10μL。梯度洗脫程序見表1。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);正離子(ESI＋)模式下的電壓為3 800 V，負(fù)離子(ESI－)模式下的電壓為2 700 V;氣化溫度為350 ℃;鞘氣為氮氣，流量為35 L·h－1;輔助氣為氮氣，流量為10 L·h－1;離子傳輸管溫度為300 ℃;質(zhì)荷比(m/z)為100～2 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 試驗方法

試樣以魚體、蝦體和貝類為樣品，魚體樣品去鱗、去皮，取肌肉組織部分;蝦體樣品去殼、去頭，取可食用部分;貝類樣品取可食用部分。經(jīng)均質(zhì)混勻后，于－18 ℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取樣品2.00 g于離心管中，加入約2 g無水硫酸鈉，攪拌混勻，加入10 m L 甲醇，渦旋振蕩5 min，超聲5 min，以9 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液。向上清液中加入500 mg中性氧化鋁和15 mg GCB，渦旋振蕩1 min，以9 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，于40 ℃下吹氮至近干，用體積比為1∶1的流動相A-流動相B 混合溶液溶解殘渣并定容至2.0 m L，經(jīng)過0.22μm 尼龍濾膜過濾，按照儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對3種藍(lán)藻毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，色譜圖見圖1。

圖1 3種藍(lán)藻毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子色譜圖Fig.1 Selective ion chromatograms of mixed standard solution of the 3 cyanobacterial toxins

2.2 儀器工作條件的選擇

質(zhì)譜條件中采用ESI＋、ESI－切換模式進(jìn)行全掃描，通過提取一級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性和定量，必要時可設(shè)置自動觸發(fā)二級質(zhì)譜進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確度，超高的分辨率有助于解析復(fù)雜的樣品，確保Q-Orbitrap系統(tǒng)能夠在一次色譜運行中最大限度的檢測和鑒定目標(biāo)物。

通過直接進(jìn)樣，對3種藍(lán)藻毒素的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別進(jìn)行ESI＋、ESI－模式全掃描，結(jié)合其結(jié)構(gòu)式及理論質(zhì)量數(shù)，確定各藍(lán)藻毒素的最佳電離模式及相應(yīng)母離子的質(zhì)量數(shù)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn):柱孢藻毒素在ESI－模式下的響應(yīng)值明顯高于ESI＋模式下的響應(yīng)值;微囊藻毒素LR 在ESI＋模式下的響應(yīng)值更高;微囊藻毒素RR 在ESI＋模式下的響應(yīng)并不強(qiáng)烈，但其在雙電荷電離模式下響應(yīng)值較強(qiáng)，形成[M ＋2 H]2＋峰，試驗將519.790 0作為其母離子。3 種藍(lán)藻毒素的質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 3種藍(lán)藻毒素的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of the 3 cyanobacterial toxins

2.3 提取條件的選擇

柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR均為親水性物質(zhì)，易溶于水，也易溶于甲醇等極性有機(jī)溶劑。甲醇等有機(jī)溶劑可使水產(chǎn)品中的蛋白雜質(zhì)變性，起到沉淀蛋白的作用。行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4319－2015中采用10 m L 甲醇對2 g水產(chǎn)品中的微囊藻毒素進(jìn)行提取，提取率較好。此外，提取液體系中若有水存在，不利于后續(xù)的凈化及濃縮過程，試驗采用加入2 g無水硫酸鈉的方法來吸收提取液體系中的水分。因此，試驗選擇的提取體系由提取溶劑10 m L甲醇和吸水劑2 g無水硫酸鈉組成。

2.4 凈化條件的選擇

MATTAROZZI等[16]采用HRMS對水產(chǎn)品中的親水性貝類毒素進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在提取液未經(jīng)過凈化或者凈化不充分情況下，基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致目標(biāo)物信號降低或缺失，可見基質(zhì)效應(yīng)對生物毒素類物質(zhì)在高分辨質(zhì)譜儀上的離子化及儀器響應(yīng)上具有較大的影響。QuECh ERS 提取過程中常用的凈化載體主要有十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、GCB、中性氧化鋁和無水硫酸鎂等，試驗考察了上述5種凈化載體對3種藍(lán)藻毒素回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 5種不同的凈化載體對3種藍(lán)藻毒素回收率的影響Fig.3 Effects of 5 different purification carriers on the recovery of the 3 cyanobacteria toxins

由圖3可知:凈化載體PSA 對微囊藻毒素LR和微囊藻毒素RR 的回收率均低于65%;凈化載體無水硫酸鎂對微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 的回收率均在70%以上;凈化載體C18和中性氧化鋁對微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 的回收率均在88%以上。由于凈化載體PSA 對3種藍(lán)藻毒素的回收率較低，試驗選擇凈化載體C18、GCB、中性氧化鋁和無水硫酸鎂對樣品進(jìn)行凈化處理。

試驗還觀察了50 mg C18、15 mg GCB、500 mg中性氧化鋁和500 mg無水硫酸鎂作為凈化載體時對3種藍(lán)藻毒素基質(zhì)溶液凈化效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):凈化載體C18對油脂的吸附效果不明顯;凈化載體GCB能將基質(zhì)中的天然色素去除，凈化后的溶液基本無色素雜質(zhì);凈化載體中性氧化鋁能有效降低基質(zhì)溶液中的油脂含量，是4種凈化載體中對油脂吸附能力最明顯的;凈化載體無水硫酸鎂雖然對油脂等雜質(zhì)具有一定的吸附能力，雜質(zhì)含量有所減少，但其凈化效果不突出。綜合考慮，試驗選擇的凈化載體由500 mg中性氧化鋁和15 mg GCB組成。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

試驗采用空白樣品基質(zhì)配制混合工作溶液系列，用溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以工作曲線的斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比k來評價基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)k小于1時為基質(zhì)減弱效應(yīng);當(dāng)k等于1時無基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)k大于1時為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 和微囊藻毒素RR 的k分別為0.582，0.721，0.773，說明3種藍(lán)藻毒素的基質(zhì)效應(yīng)均為基質(zhì)減弱效應(yīng)，試驗需要采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液系列對3種藍(lán)藻毒素進(jìn)行定量分析。

2.6 工作曲線、檢出限和測定下限

用空白基質(zhì)溶液將3種藍(lán)藻毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為10，20，50，100，200μg·L－1的混合工作溶液系列，按照試驗方法對其進(jìn)行測定。以3種藍(lán)藻毒素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。3種藍(lán)藻毒素的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

分別以3倍信噪比和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗

試驗以空白鯽魚和黃魚樣品作為基質(zhì)，對其添加10，20，50μg·kg－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照儀器工作條件對每個加標(biāo)樣品平行測定6次，計算3種藍(lán)藻毒素的回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3 可知:3 種藍(lán)藻毒素的回收率為68.3%～104%，測定值的RSD 為7.7%～17%。

2.8 實際樣品的測定

按照試探方法對從市場采購的2個鯽魚樣品、2個螺螄樣品、2個黃魚樣品和2個蟶子樣品進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1個螺螄樣品中檢出了微囊藻毒素RR，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.3μg·kg－1;其余樣品中均未檢出藍(lán)藻毒素。

本工作基于Qu ECh ERS 前處理技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中柱孢藻毒素、微囊藻毒素LR 及微囊藻毒素RR 等3種藍(lán)藻毒素的HPLC-HRMS分析方法。該方法操作簡便可行，靈敏度良好，可滿足日常分析要求。同時，在將來的研究過程中，也可為推廣并應(yīng)用于其他藻類毒素的檢測提供參考。