高再冕，李萬順

(1.平頂山市平煤總醫(yī)院 口腔科，河南 平頂山467000;2.鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院 口腔科，河南 鄭州467000)

正畸治療中牙移動(dòng)以牙周組織改建為生物學(xué)基礎(chǔ)[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)牙周膜細(xì)胞分化、功能及牙周膜、牙槽骨生理代謝調(diào)控具有非常重要的作用。wnt3a在骨陷窩中表達(dá)，屬于wnt蛋白一種重要的亞型[3]。通過與細(xì)胞膜受體結(jié)合激活該通路，是一種潛在的干細(xì)胞，對(duì)促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子具有誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的自我更新及組織修復(fù)[4]。同時(shí)，可抑制糖原合成激酶-3β對(duì)β-catenin的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的大量蓄積[5]。β-catenin是一種具有細(xì)胞黏附作用以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的多功能蛋白，在經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[6,7]。本研究通過探索正畸牙齒過程中加力1、3、5、7、10、14天后張力區(qū)、壓力區(qū)Wnt3a、β-catenin蛋白、 mRNA表達(dá)的變化來證實(shí)wnt3a、β-catenin對(duì)成骨細(xì)胞分化、骨量調(diào)節(jié)的作用及在正畸牙齒移動(dòng)過程中對(duì)牙周組織改建的影響。現(xiàn)將報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取7周齡健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量220-250 g，喂養(yǎng)于自由進(jìn)食進(jìn)水、光照12 h、室溫23℃-25℃、相對(duì)濕度45%-60%的環(huán)境中；所有實(shí)驗(yàn)大鼠購買自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

建立大鼠正畸治療中牙移動(dòng)的模型，選擇7周齡、220-250克左右健康SD大鼠48只(均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，根據(jù)加力后第1、3、5、7、10、14天進(jìn)行分組，每組8只。麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射，將麻醉后大鼠固定。用結(jié)扎絲將大鼠左上頜第一磨牙與中切牙之間結(jié)扎并拴上施加50克力的鎳鈦螺旋拉簧。將第一磨牙拉向正中，以上頜切牙軸角近牙齦處拉出0.5 mm左右的深槽溝并用樹脂固定。對(duì)照組為右側(cè)未安裝正畸加力裝置組。

1.3 組織制備

全麻后采用心臟灌注的方式將大鼠處死，將上頜兩側(cè)第一磨牙及其牙周組織完整保留。用4%的多聚甲醛固定48 h后用15%ph=7.4的EDTA微波脫鈣6周，流水沖洗24 h，再用系列乙醇-正丁醇脫水，二甲苯透明，浸蠟。包埋面定位上頜三顆磨牙腭側(cè)面，以平行于上頜磨牙牙體長(zhǎng)軸為標(biāo)準(zhǔn)，近、遠(yuǎn)、中向連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，并進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。

1.4 免疫組化檢測(cè)

兔抗大鼠多克隆抗體1∶100由北京博奧森生物試劑公司提供，sv0002-兔IgG兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒及DAB顯色盒均購自武漢博士德生物公司。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒及顯色盒的規(guī)定進(jìn)行。選取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)第一磨牙近中根近中、遠(yuǎn)中牙周膜的高倍鏡視野進(jìn)行攝像，所得攝像存于Image-ProPlus6.0系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算各組標(biāo)本陽性染色區(qū)域的平均光密度。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-PCR法

1.5.1總RNA的提取 取大鼠第一磨牙壓力側(cè)、左側(cè)上頜第一磨牙、右側(cè)上頜第一磨牙牙槽骨組織均100 mg放入研磨缽中加液氮進(jìn)行研磨。取組織粉末至于1.5 ml的EP管中加1 ml Trizol劇烈震蕩15 s后室溫條件下靜置5-10 min加200 ml氯仿在12 000 rpm的條件下離心15 min，取400-500 μl上層水相加入0.5 ml乙丙醇充分混勻，在12 000 rpm條件下離心10 min棄異丙醇。加1 ml 75%乙醇混勻在8 000 rpm離心條件下進(jìn)行離心5 min倒掉乙醇。濾紙上曬干5 min得到總RNA。

1.5.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 體系如下：5 μl的5×Reaction Buffer、3 μl 10 mM dNTP Mixture、1 μl oligodT、1 μl RNase Inhitor、1 μl Reverse Transcriptase 、3 μg Total RNA、14 μl DEPC H2O混勻后快速離心1次放入PCR儀中。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：40℃1 h、70℃5 min置于-20℃條件下冰箱保存。PCR反應(yīng)體系具體為：10 μl 2×Taq PCR Master Mix、0.15 μl rTaq酶、1 μl 上游引物、1 μl 下游引物、3 μl 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、4.85 μl ddH2O PCR反應(yīng)條件為35個(gè)循環(huán)，95℃30 s，58℃20 s，72℃25 s，GAPDH為內(nèi)參物，最終得到wnt3a、β-catenin mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)情況

不同時(shí)間組別壓力區(qū)、張力區(qū)大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，壓力區(qū)和張力區(qū)β-catenin蛋白表達(dá)分別于加力后第5天和第7天達(dá)高峰，而Wnt3a蛋白表達(dá)均于加力后第5天達(dá)高峰，見圖1，圖2；不同時(shí)間組別對(duì)照區(qū)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A、B、C、D、E、F組張力區(qū)的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照區(qū)和壓力區(qū)(P<0.05)； C、D、E、F組壓力區(qū)的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照區(qū)(P<0.05)，見表1、表2。

圖1 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin蛋白表達(dá)

圖2 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a蛋白表達(dá)

表1 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin蛋白表達(dá)情況光密度值)

注：與同組對(duì)照區(qū)比較，*P<0.05；與同組壓力區(qū)比較，#P<0.05。與同區(qū)C組比較，△P<0.05；與同區(qū)D組比較，□P<0.05

2.2 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)情況

不同時(shí)間組別壓力區(qū)、張力區(qū)大鼠牙周組織的Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，均隨時(shí)間的推移呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，壓力區(qū)和張力區(qū)β-catenin mRNA表達(dá)均于加力后第7天達(dá)高峰，而Wnt3a mRNA表達(dá)均于加力后第5天達(dá)高峰，見圖3，圖4；不同時(shí)間組別對(duì)照區(qū)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A、B、C、D、E、F組張力區(qū)的Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)均顯著的高于對(duì)照區(qū)和壓力區(qū)(P<0.05)； C、D、E、F組壓力區(qū)的Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)均顯著的高于對(duì)照區(qū)(P<0.05)。Wnt3a、β-catenin mRNA表達(dá)電泳圖見圖5、圖6。

表2 不同組大鼠牙周組織的Wnt3a蛋白表達(dá)情況光密度值)

注：與同組對(duì)照區(qū)比較，*P<0.05；與同組壓力區(qū)比較，#P<0.05。與同區(qū)C組比較，△P<0.05

圖3 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin mRNA表達(dá)

圖4 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a mRNA表達(dá)

圖5 各組不同區(qū)域β-cateninPCR電泳圖

圖6 各組不同區(qū)域Wnt3am PCR電泳圖

表3 不同組別大鼠牙周組織的β-catenin mRNA表達(dá)情況相對(duì)表達(dá))

注：與同組對(duì)照區(qū)比較，*P<0.05；與同組壓力區(qū)比較，#P<0.05。與同區(qū)D組比較，△P<0.05

表4 不同組別大鼠牙周組織的Wnt3a mRNA表達(dá)情況相對(duì)表達(dá))

注：與對(duì)照區(qū)比較*P<0.05，與壓力區(qū)比較#P<0.05；與同區(qū)C組比較，△P<0.05

3 討論

正畸作用下壓力區(qū)牙周膜受壓變窄常會(huì)引起破骨細(xì)胞活躍，并促進(jìn)相關(guān)因子表達(dá)，從而增強(qiáng)骨吸收[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[9]正畸過程中加注wnt3a信號(hào)通路抑制劑DKK1阻斷wnt信號(hào)通路。主要機(jī)制是通過直接或間接手段與wat蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白，從而使信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞的能力減弱，骨形成減少。說明干擾wnt蛋白通路可影響破骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨吸收程度，進(jìn)一步阻礙骨重建。wt3a是want信號(hào)通路重要的Wnt蛋白亞型，對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化、成熟起著重要的調(diào)控作用，同時(shí)還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌相關(guān)因子發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，對(duì)促進(jìn)成骨、抑制骨吸收均具有重要意義。外在機(jī)械力作用成骨細(xì)胞影可響骨改建[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]牙周復(fù)合體中某些細(xì)胞能夠響應(yīng)wnt刺激。通過激活或抑制wnt/β-catenin信號(hào)通路能導(dǎo)致牙周膜中成骨因子的表達(dá)水平的改變，從而對(duì)牙周膜寬度及牙槽骨更新造成影響。此外，wnt3a作為經(jīng)典wnt蛋白的配體，通過對(duì)成骨細(xì)胞分化的直接誘導(dǎo)作用、對(duì)破骨細(xì)胞分化的礦化及抑制作用以及相關(guān)功能的表達(dá)來調(diào)控骨改建。研究結(jié)果顯示A、B、C、D、E、F組張力區(qū)的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)均顯著的高于對(duì)照區(qū)和壓力區(qū)(P<0.05)； C、D、E、F組壓力區(qū)的Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)均顯著的高于對(duì)照區(qū)(P<0.05)與李爭(zhēng)爭(zhēng)等發(fā)現(xiàn)[12]wnt3a蛋白在骨折愈合過程損傷部位的表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致。說明wnt/β-catenin信號(hào)通路通過上調(diào)wnt3a表達(dá)提高骨損傷修復(fù)能力。wnt3a在張力區(qū)表達(dá)上調(diào)程度顯著。其原因主要是由于wnt3a作為促進(jìn)成骨細(xì)胞形成且向骨細(xì)胞分化及抑制骨細(xì)胞吸收的重要want蛋白亞型，在機(jī)械力刺激的條件下表達(dá)增強(qiáng)。張力區(qū)牙周膜受牽拉增寬，成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a表達(dá)上調(diào)，可充分說明上調(diào)wnt3a mRNA水平使wnt3a分泌增加，促進(jìn)骨重建。相關(guān)研究證實(shí)[13]基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)是骨細(xì)胞分化過程中重要的物質(zhì)，可調(diào)控膠原分泌及骨基質(zhì)成分組成，最終影響骨改建。經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)通路、骨形態(tài)蛋白-2是MMP-13重要的調(diào)控蛋白。其水平的增加能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分泌與本研究結(jié)果一致。

β-catenin信號(hào)通路受wnt蛋白家族的影響，wnt蛋白通過與受體結(jié)合后可抑制β-catenin被磷酸化，使其在細(xì)胞質(zhì)中大量蓄積，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。β-catenin是內(nèi)源性骨量調(diào)節(jié)者，同時(shí)也是具有細(xì)胞間黏附和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的多功能蛋白。本研究結(jié)果顯示β-catenin蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)，充分說明其在正畸牙齒移動(dòng)牙周組織改建過程中意義重大。其機(jī)制主要通過經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)。Wnt3a、β-catenin可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中護(hù)骨素(OPG)的表達(dá)與楊先炯等報(bào)道[14]間充質(zhì)細(xì)胞中want3a激活的經(jīng)典wnt信號(hào)途徑使OPG表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致。更有體外研究證明[15]缺乏 β-catenin可致成骨細(xì)胞成熟和礦化受阻，OPG含量下降，破骨細(xì)胞活躍，不利于骨重建。由此推斷Wnt信號(hào)通過影響OPG生成，決定牙周疾病進(jìn)展及牙槽骨組織的改建。

綜上所述，大鼠行正畸治療中牙移動(dòng)中，Wnt3a、β-catenin mRNA蛋白表達(dá)上調(diào)，參與牙周組織重建，并且主要于第5天、第7天達(dá)到高峰。本研究的創(chuàng)新之處在于，通過分析正畸牙齒移動(dòng)過程中加力1、3、5、7、10、14天后張力區(qū)、壓力區(qū)Wnt3a、β-catenin蛋白、 mRNA表達(dá)的變化，進(jìn)而證實(shí)Wnt3a、β-catenin對(duì)成骨細(xì)胞分化、骨量調(diào)節(jié)的重要作用。確定其在正畸牙齒過程中牙周組織改建中的影響，對(duì)正畸效果的評(píng)價(jià)提供科學(xué)的指標(biāo)。