鄒文婧，周玉爽，李 杰，高盼盼，李金澤

(吉林大學第二醫(yī)院 麻醉科手術(shù)室，吉林 長春130041)

超急性期腦梗死是腦缺血導致的一種急性并發(fā)癥，是目前中國所有疾病中第二位致死性疾病[1]，主要治療手段包括溶栓治療和血栓切除治療，但是上述治療只限于發(fā)病6 h之內(nèi)，否則會出現(xiàn)嚴重的缺血再灌注損傷[2]。因此快速的診斷此類疾病將決定患者當前治療手段和遠期預后。血清診斷標志物被認為是當前能快速提供疾病診斷消息的一類臨床檢驗方法。和傳統(tǒng)的血清診斷標志物相比，非編碼RNA(微小RNA，microRNA)已經(jīng)被證實在腦梗死疾病初期呈現(xiàn)差異性表達[3]，并且有作為腦梗死診斷血清標志物的潛在可能，但因腦梗死發(fā)病階段和發(fā)病原因較多，尤其是超急性期腦梗死目前尚無有效的血清標志物發(fā)現(xiàn)。故本文通過對microRNA-16-5p進行高通量信息分析及血清標本驗證來明確其在超急性期腦梗死中的診療價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月—2018年6月就診于吉林大學第二醫(yī)院超急性期腦梗死患者41例。入選標準：中風發(fā)作至入院時間少于6 h。排除標準：伴隨嚴重的心血管疾病、血液疾病、感染及惡性腫瘤患者。其中男28例，女性13例，全部患者平均年齡62.1±13.9歲，身高168.3±6.9厘米，體重74±8.8公斤。對照組為同期在門診就診的健康體檢患者。本實驗經(jīng)吉林大學學第二醫(yī)院倫理委員會審核并批準，所有入組患者對本項目知情同意并允許血液樣本為科研所用。

1.2 高通量生物信息分析方法mircroRNA基因芯片表達結(jié)果GSE86291來源于GEO數(shù)據(jù)庫。其中GSE86291包含7例超急性期腦梗死患者和4例健康對照組血液。通過GEO2R軟件進行差異表達統(tǒng)計分析，差異表達篩選標準為(差異倍數(shù)在2倍以上及P<0.05)。miRDB(http://www.mirdb.org/cgi-bin/search)提供mircroRNA調(diào)控的下游靶基因預測。基因本體分析(GO analysis)對下游靶基因進行計算，京都基因及基因組百科全書信號通路分析(KEGG analysis)對靶基因進行信號通路的預測?；蛐盘枤馀輬D應(yīng)用R語言 affy和limma數(shù)據(jù)包處理后繪制。

1.3全部患者外周血液RNA采用microRNA專用快速提取試劑盒提取(BIOTEKE 試劑盒)，micro RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA采用BIOTEKE miR RNA cDNA第一鏈合成試劑盒。實時定量PCR操作儀器為ABI公司生產(chǎn)的7500 Real time PCR機器，采用BioTeke miRNA qPCR Detection Kit(SYBR Green)試劑盒，每組樣品均設(shè)3 個重復。

2 結(jié)果

2.1 GSE86291芯片分析結(jié)果對2006個芯片進行檢測發(fā)現(xiàn)3個差異下調(diào)表達的基因，28個差異上調(diào)表達的基因，1975個無明顯差異表達的基因。其中microRNA-16-5p為差異下調(diào)表達的基因，P值為0.02416，差異表達倍數(shù)為4.78倍。

2.2 基因本體分析結(jié)果顯示生物過程集中在蛋白質(zhì)磷酸化、磷脂酰肌醇介導的信號傳導、蛋白質(zhì)泛素化、細胞遷移負調(diào)控和泛素依賴性蛋白分解代謝過程。細胞組成集中在細胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)、突觸和循環(huán)內(nèi)質(zhì)。分子功能集中在蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性和蛋白激酶活性，見表1和圖1。

表1 基因本體分析結(jié)果

注：基因本體分析結(jié)果：生物過程，細胞組成，分子功能

圖1 基因本體分析結(jié)果

圖2 京都基因及基因組百科全書信號通路

2.3 京都基因及基因組百科全書信號通路分析MAPK信號通路、腫瘤通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、PI3K-Akt信號通路和調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路。信號通路氣泡圖見圖2，其中漸變色代表p值，黑點的大小代表基因數(shù)。

2.4在獲取的急性期腦梗死中患者及健康患者血液標本驗證，microRNA-16-5p 在2組血液標本中呈現(xiàn)差異性表達，RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn) microRNA-16-5p在腦梗死組和對照組之間呈現(xiàn)差異性低表達，差異表達倍數(shù)2-ΔΔCt=2.107差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

急性腦梗死是因腦血管急性閉塞而導致腦組織缺血缺氧性疾病，目前占中國因卒中而死亡的第一位。而超急性腦梗死一經(jīng)診斷需要緊急臨床干預，其黃金治療時期在梗死后1-6 h內(nèi)。目前針對腦梗死的診斷措施尚無快速有效的方法，一般多在發(fā)生癥狀后先行頭部CT檢查排除腦出血后再行頭部核磁共振平掃加彌散檢查來確認腦梗死[4]。但核磁共振彌散檢查往往是根據(jù)缺血缺氧腦組織因能量代謝異常而導致水分子彌散受到限制來診斷腦梗死，但是腦缺血到發(fā)生血管源性水腫一般需要5 h左右，故對腦梗死的早期診斷有一定的延誤。

血清標志物因檢查方便且迅速被認為能快速提供腦梗死診斷信息。一些研究報道白細胞介素-10，腫瘤壞死因子-α，C反應(yīng)蛋白，D二聚體，β2-微球蛋白、膽堿酯酶[5-7]對腦梗死的早期診斷有一定的價值。但是這些診斷標志物特異性差，而且這些物質(zhì)是針對炎癥反應(yīng)進行檢測，一般炎癥反應(yīng)均是在腦組織缺血缺氧一段時間后方會出現(xiàn)體內(nèi)炎癥介質(zhì)的異常改變，故不適合快速診斷。因此一些研究開始關(guān)注腦組織在缺血后自身分泌的異常物質(zhì)進行檢測來快速診斷腦梗死。其中microRNA-16被認為是一種能夠提供腦梗死診斷信息的一類非編碼RNA[8]。其被報道是在腦梗死后患者血清中出現(xiàn)的一種低表達的血清標志物。

通過我們對腦梗死患者血液的檢測我們發(fā)現(xiàn)microRNA-16-5p確實在腦梗死患者中表達較正常人要低，可能是在腦組織缺血后自身釋放出的物質(zhì)。而對microRNA-16-5p進行下游調(diào)控分析我們發(fā)現(xiàn)，其控制的白細胞介素7，腫瘤壞死因子受體，說明在炎癥反應(yīng)前microRNA-16-5p已經(jīng)出現(xiàn)異常，從而引起機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，說明檢測microRNA-16-5p變化對腦梗死的診斷價值可能早于對炎癥因子的診斷。而基因本體分析提示蛋白質(zhì)磷酸化可能是microRNA-16-5p調(diào)控下游基因的主要生物過程，基因百科全書信號通路分析均鎖定在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是主要的信號通路。而MAPK信號通路已被很多研究證實和急性腦缺血相關(guān)[9,10]。因此microRNA-16-5p很可能是在腦梗死早期即出現(xiàn)的一種發(fā)生變化的血清標志物。

總之，microRNA-16-5p已在我們所搜集的全部腦梗死超急性期患者外周血清中呈現(xiàn)差異性低表達，診斷陽性率較高。這種在腦梗死超急性期內(nèi)即發(fā)生改變的非編碼RNA有可能在腦梗死病人的最早期被臨床所檢測出來，為腦梗死超急性期患者的后續(xù)治療提供寶貴的治療時間。