李凱迪，王 海，鄭 巖，何成彥，齊 新

(吉林大學(xué)白求恩第三醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130033)

2018年全球約有88萬人死于結(jié)直腸癌，在癌癥死亡率中排名第二[1]。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诜治鯩YH10在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量及臨床意義，為結(jié)直腸癌的診斷探索新的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究所納入的標(biāo)本為吉林大學(xué)白求恩第三醫(yī)院2016年7月到2017年1月經(jīng)手術(shù)獲得的經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)所證實(shí)為結(jié)直腸癌Dukes B期腺癌，在術(shù)前未接受任何治療，且排除已發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者的新鮮結(jié)直腸癌組織，共計(jì)23例。癌旁標(biāo)本為距離癌組織10 cm以上且位于癌組織上段的正常組織。所有患者和家屬均簽署知情同意書。將依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)所獲取的新鮮組織沖洗后，經(jīng)液氮速凍后，置于-80℃的冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1樣本總蛋白提取及測(cè)定 從-80℃的冰箱中，取癌組織和癌旁組織各50 mg于PBS中清洗，在液氮中充分研磨后，分別加入適量RIPA裂解緩沖液，置于冰上，室溫下，使用振蕩器充分混勻。加入RNA酶和DNA酶去除RNA和DNA后離心。離心機(jī)設(shè)置為12 000 rpm，4℃，離心15 min。離心后，留取上層清液即為總蛋白。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定根據(jù)Bradford法，即使用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，使用分光光度計(jì)在595 nm處進(jìn)行測(cè)量。繪制橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)濃度，縱坐標(biāo)為吸光度的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2蛋白水解多肽混合物的制備 取凍存的總蛋白樣品，置于室溫下融化。用5倍體積的50 mmol/L NH4HCO3溶解稀釋蛋白樣品。加入一定體積的1 mol/L的DTT，最終調(diào)定濃度為20 mmol/L，56℃下避光放置反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后加入一定體積的1 mol/L的IAM，調(diào)定濃度至50 mmol/L，室溫避光的條件下，使其充分反應(yīng)30 min。在反應(yīng)體系中按蛋白∶胰酶以50∶1的比例加入測(cè)序級(jí)胰酶，置于37℃水浴箱中過夜，所得產(chǎn)物分裝后置于-80℃的冰箱中保存。

1.2.3二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析 取經(jīng)上述步驟制得的樣品加入0.1%FA溶解樣品。取50 μg用于色譜上樣，蛋白樣品在流經(jīng)強(qiáng)陽離子柱和反相柱時(shí)被洗脫分離，所獲得的多肽經(jīng)LTQXL離子肼質(zhì)譜分析后，最終得到LC/MS圖譜。

1.2.4免疫印跡試驗(yàn) 用免疫印跡試驗(yàn)分別測(cè)定目的蛋白(MYH10)在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況，以驗(yàn)證二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析結(jié)果。

1.2.5儀器和試劑 考馬斯亮藍(lán)、二硫代蘇糖醇(DTT)、NH4HCO3、碘代乙酰胺(IAM)、尿素、DNA酶、RNA酶購于美國Sigma公司，十二烷基硫酸鈉(SDS)、TMED、蛋白質(zhì)定量試劑盒、TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶購于Bio-Rad公司，苯甲基磺酰氟(PMSF)購于美國GE公司，MYH10單克隆抗體購于美國Abcam公司。Agilent 1200高效液相色譜儀購于美國Agilent公司，LTQXL離子肼質(zhì)譜儀購于美國Thermo Fisher公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)直腸癌組織和癌旁組織

本實(shí)驗(yàn)癌組織樣本和癌旁組織樣本中同一個(gè)蛋白的豐度通過譜圖數(shù)以衡量。我們將同時(shí)滿足兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)比值≥1及兩個(gè)樣本中蛋白譜圖數(shù)差值≥72的蛋白定為差異表達(dá)蛋白，依照上述標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)所研究的MYH10蛋白為上調(diào)蛋白，MYH10質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

圖1 MYH10質(zhì)譜圖

2.2 免疫印跡試驗(yàn)分析MYH10在結(jié)直腸癌和癌旁組織的表達(dá)

使用免疫印跡試驗(yàn)分析MYH10在結(jié)直腸癌組織和與之相對(duì)的癌旁組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MYH10蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，與二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所獲得的結(jié)果一致，免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 MYH10在癌旁組織(A)、結(jié)直腸癌組織(B)

3 討論

非肌肉肌球蛋白(NMM-Ⅱ)是一種六聚體分子，由2條重鏈、2條調(diào)節(jié)性輕鏈和2條必須輕鏈所構(gòu)成的。其3種亞型分別為NMMⅡ-A、NMMⅡ-B和NMMⅡ-C分別由MYH9、MYH10和MYH14基因編碼[2]。有報(bào)道表明NMM-Ⅱ作為細(xì)胞骨架的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，參與了如細(xì)胞活化、囊泡轉(zhuǎn)移等一系列的細(xì)胞活動(dòng)[3]。

MYH10作為超家族蛋白質(zhì)編碼基因之一，位于17p13.1,廣泛的存在于不同的細(xì)胞和組織中[4]。除了參與正常的細(xì)胞生理活動(dòng)，同時(shí)與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。Liu等人通過對(duì)膀胱癌的研究證實(shí)，MYH10可以作為影響膀胱癌患者預(yù)后的候選生物標(biāo)志物之一[6]。Bluteau等人的研究表明，MYH10受RUNX1基因負(fù)向調(diào)控，當(dāng)RUNX1基因缺失，MYH10在血小板中持續(xù)性表達(dá)，遺傳性和獲得性血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生可能與之相關(guān)?？梢詫z測(cè)MYH10基因作為血液系統(tǒng)惡性腫瘤的篩選標(biāo)記物[7]。劉等人的研究表明，MYH10基因的表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲的能力高度相關(guān)。該研究還證實(shí)MYH10基因的表達(dá)量與卵巢癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及腸道轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可以作為卵巢癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素[8]。Guo等人的研究認(rèn)為MYH10基因可以改變ECM(細(xì)胞外基質(zhì))[9]。大量的研究表明，腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化對(duì)腫瘤的發(fā)展起著重要的調(diào)控作用[10]。Wang等人沉默人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的MYH10基因后發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路受到抑制[11]，先前的研究表明，Wnt/β-catenin通過促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),即上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，大大提升了腫瘤的抗凋亡能力，使細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強(qiáng)。而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[12]。Surcel等人的研究表明4-羥基苯乙酮(4-HAP)通過靶向調(diào)控MYH10以及MYH14改變細(xì)胞力學(xué)，減弱了胰腺癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供了新思路[13,14]。先前的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展起到了關(guān)鍵的作用[15]。MYH10基因是否通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，增強(qiáng)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，最終影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)通過二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁組織的MYH10蛋白表達(dá)情況，并通過免疫印跡的方法得以驗(yàn)證，結(jié)果顯示MYH10蛋白在結(jié)直腸腫瘤組織中明顯升高，可以作為診斷結(jié)直腸腫瘤的候選生物標(biāo)志物之一。