張海云，蔡曉波，郭寶明，李建周

(1.西寧市第二人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，青海 西寧810003；2.上海市第一人民醫(yī)院 消化內(nèi)科,上海200080)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)為惡心、吞咽困難、厭食、腹瀉、反酸等，具有較高的致死率。目前對胃癌的治療以手術(shù)聯(lián)合化療為主，但由于胃癌細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，因而腫瘤生長迅速，且能迅速發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而胃癌預(yù)后較差，其5年生存率不足40%[1]。幽門螺旋桿菌(Hp)是一種革蘭陰性菌，可在內(nèi)黏膜上皮內(nèi)繁殖。有研究表明，Hp感染與胃癌密切相關(guān)[2]。細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)是G1/S期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的正向調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖過程中具有關(guān)鍵作用，而胃癌與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[3]。核因子kb(NF-kb)是功能性蛋白質(zhì)，其表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性，誘發(fā)腫瘤。自噬是細(xì)胞清除病原體的機(jī)制，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中會(huì)出現(xiàn)自噬異常。但Hp感染CyclinD1、NF-kb、自噬相關(guān)蛋白Beclin1、臨床病理特征的關(guān)系如何，目前報(bào)道較少?；诖?，本文以胃癌患者為研究，提高檢測是否Hp感染，分析Hp感染與CyclinD1、NF-kb、Beclin1表達(dá)、臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)將研究作如下報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2015年1月-2018年12月在我院診治的胃癌患者80例作為研究對象，其中男58例，女22例，年齡35-75歲，平均年齡(53.86±12.65)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)胃鏡和病理檢查確診為胃癌；②本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；③患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月如出現(xiàn)大出血、嚴(yán)重胃穿孔者；②嚴(yán)重肝腎脾等臟器器質(zhì)性病變者；③精神疾病等嚴(yán)重影響本研究者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1石蠟切片制備 采用10%的福爾馬林固定活檢標(biāo)本，使用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm厚度的切片。

1.2.2Hp檢測 采用改良Giemsa染色法和13C呼氣試驗(yàn)對Hp進(jìn)行檢測，改良Giemsa染色法：將石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水后，采用2%的Giemsa染色劑進(jìn)行30 min的染色，采用自然水洗后置入純酒精內(nèi)進(jìn)行脫水，應(yīng)用二甲苯進(jìn)行透明，樹膠進(jìn)行封固，在油鏡下觀察Hp；13C呼氣試驗(yàn)：讓患者空腹6 g以上后再收集100 ml呼氣，口服13C標(biāo)記的尿素再收集100 ml呼氣，連接13C標(biāo)記的紅外線能譜儀的檢測孔進(jìn)行檢測，DOB>2.5則為陽性。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：改良Giemsa染色法和13C呼氣試驗(yàn)均為陽性則為陽性，否則為陰性。

1.2.3CyclinD1、NF-kb、Beclin1檢測 采用免疫組化法檢測CyclinD1、NF-kb、Beclin1的陽性率，將石蠟切片進(jìn)行80 min的烤片(60℃)，常規(guī)脫蠟、水化組織切片后進(jìn)行組織抗原修復(fù)(高溫高壓)，滴入3%的雙氧水以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后加入20 μl的免疫人CyclinD1多克隆抗體、免疫人NF-kb多克隆抗體、免疫人Beclin1多克隆抗體，按照1∶200倍對抗體進(jìn)行稀釋，將切片放入濕盒內(nèi)過夜(4℃)，第二天采用PSB沖洗3次，滴入生物素標(biāo)記的一抗，進(jìn)行30 min的孵育(37℃)，采用PSB沖洗，滴入生物素標(biāo)記的二抗，進(jìn)行30 min的孵育(37℃)，采用PSB沖洗，然后DAB顯色，采用蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，并進(jìn)行脫水封片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取5-10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察，以100個(gè)細(xì)胞數(shù)為1個(gè)視野進(jìn)行計(jì)分，陽性細(xì)胞率5%、5%-24%、25%-49%、>50%的分別記0分、1分、2分、3分；以著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，呈淡黃色、黃色、棕黃色分別記1分、2分、3分；兩種計(jì)分的乘積0分則為陰性、1-3分則為弱陽性、4-6分則為中陽性、7-9分則為強(qiáng)陽性，陽性率=(總例數(shù)-陰性)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 CyclinD1、NF-kb、Beclin1陽性率比較經(jīng)Hp檢測，Hp感染陽性55例(68.75%)。Hp感染患者CyclinD1、NF-kb、Beclin1陽性率分別為76.36%、63.64%、60.00%，與非Hp感染患者的48.00%、12.00%、36.00%比較明顯較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 胃癌患者Hp感染與CyclinD1、NF-kb、Beclin1陽性率比較

2.2 Hp感染與CyclinD1、NF-kb、Beclin1陽性率的相關(guān)性胃癌患者Hp感染與CyclinD1陽性率呈正相關(guān)(r=0.281，P=0.012<0.05)，與NF-kb陽性率呈正相關(guān)(r=0.479，P=<0.001)，與Beclin1陽性率呈正相關(guān)(r=0.223，P=0.047<0.05)。

2.3 Hp感染與臨床病理特征的關(guān)系胃癌患者不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、組織分化程度、組織分化類型的Hp感染率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。臨床分期Ⅰ-Ⅱ期的Hp感染率為50.00%，與Ⅲ-Ⅳ期的84.09%比較明顯較低，浸潤程度T1+T2的Hp感染率為58.49%，與T3+T4的88.89%比較明顯較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。經(jīng)二元Logistic回歸分析，臨床分期、浸潤程度為胃癌患者Hp感染的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見表3。

表2 不同臨床病理特征胃癌患者Hp感染率比較[n(%)]

表3 胃癌患者Hp感染的多因素分析

3 討論

我國胃癌的發(fā)生率和死亡率一直處于惡性腫瘤的前列，且男性多于女性。近年來胃癌的發(fā)生率有所下降，但由于胃癌早期無特異性的臨床表現(xiàn)，因而診斷時(shí)患者已為中晚期，降低了患者的5年生存率[4]。多數(shù)研究認(rèn)為，Hp感染與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但致病機(jī)制尚未完全明了。數(shù)據(jù)資料顯示，Hp感染率一般為40%-60%[5，6]。本文研究中，80例患者Hp感染55例，約為68.75%，稍高于數(shù)據(jù)資料，可能與樣本數(shù)量及個(gè)體差異性有關(guān)。Hp感染后，可引起胃粘膜慢性、急形炎癥反應(yīng)，紊亂增生平衡與細(xì)胞凋亡，使胃癌相關(guān)基因變異，增加起端粒酶活性，胃黏膜上皮細(xì)胞線粒體基因發(fā)生變異，從而促進(jìn)形成胃癌[7，8]。

CyclinD1定位于11p13，總長約15 kb，有外顯子5個(gè)，內(nèi)含子4個(gè)，是位于細(xì)胞核的G1期細(xì)胞增殖信號的一種蛋白。正常情況下，細(xì)胞進(jìn)入S期CyclinD1就會(huì)迅速分解，當(dāng)CyclinD1被激活且持續(xù)高表達(dá)時(shí)，將會(huì)縮短G1期，提前進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，從而形成腫瘤[9,10]。本文研究中，Hp感染患者CyclinD1陽性率為76.36%，明顯高于非Hp感染患者的48.00%；胃癌患者Hp感染與CyclinD1陽性率呈正相關(guān)。研究結(jié)果表明CyclinD1的高表達(dá)胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能與CyclinD1高表達(dá)促進(jìn)G1期到S期的轉(zhuǎn)換有關(guān)。NF-kb調(diào)節(jié)功能多項(xiàng)，可參與調(diào)控多種基因的炎癥、細(xì)胞增殖及凋亡、免疫應(yīng)答，與腫瘤的生長、分化和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文研究中，Hp感染患者NF-kb陽性率為63.64%，明顯高于非Hp感染患者的12.00%；胃癌患者Hp感染與NF-kb陽性率呈正相關(guān)，與沈玲等[11]的研究結(jié)果相吻合。研究結(jié)果表明NF-kb的高表達(dá)胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)展早期，自噬可抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而在腫瘤發(fā)展晚期，自噬會(huì)為此腫瘤細(xì)胞的存活。Beclin1是自噬相關(guān)的蛋白，作為PI3K復(fù)合物形成的支架，而PI3K復(fù)合物形成自噬泡的第一步。本文研究中，Hp感染患者Beclin1陽性率為60.00%，明顯高于非Hp感染患者的36.00%；胃癌患者Hp感染與Beclin1陽性率呈正相關(guān)，與胡云峰等[12]的研究結(jié)果相一致。研究結(jié)果表明Hp感染可能能誘導(dǎo)自噬細(xì)胞活性增強(qiáng)。

本文還分析了不同臨床病理特征與Hp感染的關(guān)系，結(jié)果顯示，臨床分期Ⅰ-Ⅱ期的Hp感染率為50.00%，明顯低于Ⅲ-Ⅳ期的84.09%，浸潤程度T1+T2的Hp感染率為58.49%，明顯低于T3+T4的88.89%；經(jīng)二元Logistic回歸分析，臨床分期、浸潤程度為胃癌患者Hp感染的獨(dú)立影響因素。研究結(jié)果表明臨床分期和浸潤程度可獨(dú)立影響Hp感染，因此對于臨床分期和浸潤程度高的胃癌患者，臨床上應(yīng)積極給予預(yù)防干預(yù)措施，以減少Hp感染。綜上所述，胃癌患者Hp感染可能通過誘發(fā)CyclinD1、NF-kb、Beclin1異常參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，Hp感染與臨床分期和浸潤程度有關(guān)。