許德英，孫真真，王小利，吳玉丹，白嬌紅，常永超

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院 檢驗科，河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南 洛陽471023)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是僅次于淋巴瘤的第二大血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率為13%，占所有腫瘤的1-1.4%[1]。MM是一種難以治愈的疾病，發(fā)病機制復雜，不同患者間的預后差別特別大。關(guān)于MM的發(fā)病機制[2]，目前的研究認為是因為淋巴細胞表型和功能異常，從而引起免疫監(jiān)視功能異常，導致機體對惡性腫瘤細胞清除能力下降。而最近的研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)在大多數(shù)腫瘤中包括多發(fā)性骨髓瘤，可以作為無進展生存和總存活數(shù)的預測因子[3,4]。Qiang Z等[4]的研究報告證明NLR可以作為MM的一個預后生物標志物，對MM患者的有效治療提供幫助。較高的NLR提示MM患者預后不良，但具體機制尚不明確[5,6]。本研究旨在分析NLR、淋巴細胞亞群及免疫表型表達對MM患者OS的影響，探索NLR 升高對MM患者預后不良的可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年 1 月至 2019 年 1 月河南科技大學第一附屬醫(yī)院收治的初診 MM 患者共計95 例，所有入選患者診斷均符合張之南主編的第3版《血液病診斷及療效標準》[7]。納入研究的病例均無活動性感染、其他系統(tǒng)腫瘤及自身免疫性疾病。其中女37例，男58例。中位年齡63歲(41-89歲)。血清免疫固定電泳分型：IgG陽性67例(70.53%)，IgA陽性14例(14.74%)，IgM陽性1例(1.05%)，IgD陽性1例(1.05%)；Kappa輕鏈陽性5例(5.26%)、Lambda輕鏈陽性7例(7.37%)。ISS分期：Ⅰ期22例(23.16%)，Ⅱ期23例(24.21%)，Ⅲ期50例(52.63%)。所有納入研究的患者診斷、治療、隨訪均在河南科技大學第一附屬醫(yī)院完成。研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

鼠抗人單克隆抗體 CD45-PercP、CD38-PE、CD19-PE、CD56-PE、CD138-APC、CD20-APC、CD117-PE、CD33-APC、CD71-FITC、CD3-FITC/ CD16+CD56-PE/CD45- PercP/CD19-APC、CD3-FITC/CD8-PE/CD4-APC/CD45- PercP與陰性對照抗體小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1- PercP、IgG1- APC、溶血素、BD Truecount tube絕對計數(shù)管(包含數(shù)量已知的Beads)、和FACS Calibur流式細胞儀均購自美國Becton Dickinson公司。Kappa-FITC/Lambda-RPE購自丹麥Dako公司。全自動血液細胞分析儀(BC-6800)購自中國邁瑞公司。

1.3 實驗方法

患者于入院當日采集空腹抗凝肘靜脈血2 ml，用于測定全血細胞計數(shù)和淋巴細胞亞群分析。根據(jù)患者全血細胞計數(shù)結(jié)果，計算NLR。95例患者外周血NLR為2.80±3.23，以NLR均值2.80為分界點將患者分為高NLR組(NLR≥2.80)29例和低NLR組(NLR<2.80)66例。

1.4 淋巴細胞亞群檢測

在BD計數(shù)管中加入7 μl四色熒光試劑(CD3-FITC/ CD8-PE/CD4-APC/CD45- PercP，CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45- PercP/CD19-APC)和30 μl全血，充分混勻后避光室溫孵育30 min，加入1×溶血素400 μl,充分混勻后室溫避光孵育10 min，24 h內(nèi)上機檢測。應(yīng)用FAcsCalibur四色流式細胞儀進行檢測，MultiSET軟件進行數(shù)據(jù)分析，每個樣本測定管獲取淋巴細胞數(shù)10000個。淋巴細胞亞群絕對計數(shù)將BD計數(shù)管換成BD Truecount tube絕對計數(shù)管，方法同上。在前向散射角(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)散點圖上選定淋巴細胞群，分析MM患者外周血CD3、CD4、CD8、CD56、CD19的表達情況。

1.5 流式免疫表型檢測和分析

無菌操作取0.2 ml骨髓液進行涂片。骨髓涂片采用瑞氏染色，顯微鏡下觀察并分類計數(shù)200個有核細胞。另取2-4 ml骨髓液肝素抗凝，用四色流式細胞儀CellQuest軟件獲取每管至少分析30000個細胞，通過CD38/CD138設(shè)門圈定待檢細胞群，所有抗原表達分析均是針對 CD38++/CD138+ 細胞。陽性水平根據(jù)FITC-/PE-/Per-CP/APC-自發(fā)熒光范圍確定。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果以熒光強度<102為陰性，102-103為弱陽性，103-104為強陽性，膜抗原≥20%定義表達陽性。

1.6 預后評估方法

電話隨訪，隨訪截止日期為2019年5月1日，中位隨訪時間為29個月?？偵鏁r間(OS)是指從診斷之日到因任何原因死亡之日或最后隨訪日之間的時間。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 初診不同 NLR的MM患者OS分析

生存分析結(jié)果顯示，高NLR組的中位生存期(13個月)低于低NLR組(36個月)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為21.14，P<0.01)，生存曲線見圖1。

2.2 不同NLR組MM患者淋巴細胞亞群表達結(jié)果比較

與NLR<2.80組相比，NLR≥2.80組的T細胞絕對值，B細胞絕對值，NK細胞絕對值，CD4+細胞絕對值，CD8+細胞絕對值均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而T細胞、B細胞，NK細胞、CD4+細胞、CD8+細胞和CD4/CD8的百分比差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

圖1 初診時不同NLR的MM患者總生存曲線比較

表1 初診不同中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)多發(fā)性骨髓瘤患者的淋巴細胞亞群比較

2.3 不同NLR組MM患者免疫分型結(jié)果分析

與NLR<2.80組相比，NLR≥2.80組CD117+占51.72%(15/29例)，表達頻率增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其他抗原分子CD19、CD20、CD56、CD33、CD45、CD71、 Kappa、Lambda的表達無明顯變化。見表2。

2.4 相關(guān)性分析

分析NLR與各淋巴細胞亞群的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)NLR值與T細胞絕對值、CD4+細胞絕對值、CD8+細胞絕對值、B淋巴細胞和NK細胞絕對值呈負相關(guān)(R=-0.512，P=0.000；R=-0.479，P=0.000；R=-0.441，P=0.000；R=-0.257，P=0.012；R=-0.470，P=0.000)。見圖2-6。

表2 不同外周血中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)多發(fā)性骨髓瘤患者的免疫分型結(jié)果比較[陽性例數(shù)(%)]

圖2 NLR與T淋巴細胞絕對值相關(guān)性分析

圖3 NLR與CD4+T淋巴細胞絕對值相關(guān)性分析

圖4 NLR與CD8+T淋巴細胞絕對值相關(guān)性分析

圖5 NLR與B淋巴細胞絕對值相關(guān)性分析

圖6 NLR與NK淋巴細胞絕對值相關(guān)性分析

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是常見于老年人的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，病情進展較慢，漿細胞異常增殖和單克隆免疫球蛋白增生導致機體細胞免疫和體液免疫功能異常。因此參與免疫應(yīng)答的淋巴細胞在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病中起到了重要作用[6]。2013年，Kelkitli E等[8]就NLR與MM之間的關(guān)系進行了第一次研究報告，結(jié)果表明NLR是MM患者OS和無事件生存的潛在預后因素。國內(nèi)崔壯壯等的研究也表明初診外周血高NLR是影響MM患者預后的危險因素[9]。我們的研究結(jié)果也證明NLR≥2.80組MM患者OS明顯短于NLR<2.80組MM患者(36個月vs.13個月；Log-rankP=0.000)。高NLR往往提示預后不良，但目前機制尚不明，猜測可能一方面是因為中性粒細胞通過促進腫瘤血管生成，從而促進了腫瘤的進展[10]；另一方面淋巴細胞具有免疫監(jiān)視作用，負責腫瘤細胞的清除，在其下降的情況下，促進了腫瘤生長、侵襲[11，12]。本研究結(jié)果表明NLR≥2.80組MM患者外周血的T細胞、B細胞、NK細胞、CD4+細胞和CD8+細胞的絕對值較NLR<2.80組的數(shù)量明顯減少。相關(guān)性分析結(jié)果顯示NLR值與T細胞絕對值、CD4+細胞絕對值、CD8+細胞絕對值、B淋巴細胞和NK細胞絕對值呈負相關(guān)。這可能暗示著高NLR多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)存在細胞免疫和體液免疫功能的低下和免疫調(diào)節(jié)功能的異常。

多項研究結(jié)果表明，淋巴細胞減少是實體腫瘤和血液惡性腫瘤(包含MM)預后較差的指標[13]。國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)MM患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)存在多種缺陷，包括免疫細胞如B細胞，T細胞，NK細胞的數(shù)量異常以及功能缺陷。免疫功能障礙是MM的一個重要特征，可導致感染、腫瘤生長增強和對化療的耐藥性。Kay NE曾報道過，在新診斷的MM中，CD4+細胞和CD19+細胞的初始水平較高則預示著更長的存活時間[14]。2001年，一項研究證實了免疫細胞(B、CD4+、CD8+細胞)水平下降與MM患者生存不良有關(guān)[6]。國內(nèi)也有研究證明，在難治組的MM患者中，Th(CD3+ CD4+)細胞，TS(CD3+ CD8+)細胞和NK(CD3-CD16+CD56+)細胞均呈明顯下降[15]。Jurisic 等研究證明MM患者NK細胞功能的下降與疾病進展有關(guān)，體內(nèi)NK細胞濃度升高，生存期會延長[16]。NK細胞作為先天免疫系統(tǒng)細胞的一個重要亞群，在防御惡性腫瘤的發(fā)生和擴散中起著至關(guān)重要的作用。

通過四色流式細胞術(shù)(MFC)檢測骨髓瘤細胞表面免疫表型特點，已經(jīng)作為血液系統(tǒng)疾病的常用檢測手段，其在輔助診斷、預后評估方面的價值也被越來越多的學者認同。我們應(yīng)用流式細胞術(shù)分析了9個相關(guān)抗原標記的表達情況，結(jié)果表明CD117+表達頻率在NLR≥2.80組MM患者的骨髓瘤細胞中明顯升高。CD117是一種酪氨酸激酶，研究顯示在正常漿細胞上不表達，但可以在54%的骨髓瘤患者中檢測到。也有一些研究表明，CD117+可能代表預后較差的風險類別[17，18]，與本研究結(jié)果相一致。

總之，本次研究將初診MM患者NLR與淋巴細胞亞群聯(lián)系起來進行分析，結(jié)果顯示高NLR組的MM患者淋巴細胞亞群絕對計數(shù)均減少，CD117+表達頻率增高。這些發(fā)現(xiàn)表明初診MM患者外周血NLR的增高、淋巴細胞亞群數(shù)量的減少和CD117的異常表達可能是高NLR組不良預后的原因。