顧天天，田勇，周瑋，劉國發(fā)，陳黎，曾濤，吳信生，徐琪，陳國宏*，盧立志*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；3.周口桂柳種鴨育種有限公司，河南 周口 461300）

應激是指機體對外界或內(nèi)部的各種非常刺激（如冷熱應激、束縛、饑餓、精神刺激、過度疲勞以及感染、中毒等）所產(chǎn)生的非特異性應答反應的總和[1]。適當?shù)膽た墒箼C體逐步適應環(huán)境，提高生產(chǎn)性能。如果應激反應過強或持續(xù)時間過長，會破壞穩(wěn)定的機體內(nèi)環(huán)境，造成組織和器官的病理性損傷，嚴重時引起畜禽大批量死亡，給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。研究發(fā)現(xiàn)，在應激狀況下，動物機體腸道容易出現(xiàn)因缺血而導致的血量減少和缺氧現(xiàn)象，腸道耗氧量增加，影響腸道滲透性，進而引起無氧代謝，導致局部產(chǎn)生大量酸性代謝產(chǎn)物，腸黏膜上皮細胞受損水腫，細胞壞死[2-3]。

動物胃腸道不僅是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所，而且是動物體內(nèi)免疫器官之一。應激過程造成的腸道氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起免疫細胞的浸潤、激活導致疾病進一步發(fā)展。SAADET等研究證明，冷熱應激過程可使鼠紅細胞過氧化氫酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性升高，表明應激可能破壞機體氧化與抗氧化系統(tǒng)平衡，并通過改變酶促和非酶促2大防御體系，導致蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的大量生成，進而對機體的組織器官造成氧化損傷[4]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激啟動的凋亡途徑是一種新的凋亡途徑，與缺氧缺血損傷時的細胞凋亡有密切關系。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78,GRP78）基因作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的中樞調(diào)節(jié)因子，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激最敏感的標志[5-7]。CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancerbinding protein-homologous protein,CHOP）基因則在應激干擾時大量表達，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激密切相關[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也與細胞凋亡的發(fā)生有關。汪君民等研究表明，小鼠受到熱應激處理時Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）基因mRNA表達量顯著增加，這表明在高溫熱應激過程中存在著細胞凋亡[8]。

蛋鴨籠養(yǎng)是一種新型的養(yǎng)殖模式，不僅可以從根本上解決蛋鴨產(chǎn)業(yè)的污染問題，提高生物安全和產(chǎn)品品質(zhì)，而且可以通過實施標準化生產(chǎn)，提高蛋鴨養(yǎng)殖效益。然而，當?shù)傍喩L至一定階段，將其轉為籠養(yǎng)方式進行養(yǎng)殖的過程中會產(chǎn)生強烈的應激反應。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，特別是在蛋鴨上籠養(yǎng)殖初期，由于多種環(huán)境因素改變導致其生長緩慢、免疫力下降，甚至死亡，給養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，嚴重制約著蛋鴨籠養(yǎng)技術的推廣普及[9-11]。目前，對于上籠引起蛋鴨組織器官的形態(tài)學變化，國內(nèi)外相關研究報道甚少。本研究以紹興鴨為動物模型，上籠作為應激原，從組織學、生化指標、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激基因和炎癥基因以及凋亡基因mRNA表達水平的角度，揭示上籠應激所致的蛋鴨腸道組織器官的變化，闡明上籠應激誘發(fā)消化道相關基因mRNA表達量變化的發(fā)生機制，為蛋鴨的規(guī)?；B(yǎng)殖和上籠應激誘發(fā)癥的科學預防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

試驗選用同一條件下地面平養(yǎng)的200日齡健康紹興鴨80只，隨機分成2組：常規(guī)對照組繼續(xù)采用地面平養(yǎng)，自由采食，自由飲水；試驗處理組轉移至層疊式籠舍進行單籠飼養(yǎng)，籠子規(guī)格為28 cm×40 cm×40 cm，通過乳頭飲水器飲水，食槽喂食，自由采食。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與處理

于上籠的第1、2、4、7、10天，在選取的各個時間點，每組分別隨機抽取5只紹興鴨，采集血樣后，頸部放血處死，打開腹腔，分離出十二指腸，在固定位置剪取2段，其中一段用無菌生理鹽水輕輕晃動去除腸道內(nèi)容物后，剪成2份，置于液氮中保存；另一段置于4%甲醛溶液中進行固定。本研究所用動物按照《實驗動物福利倫理審查指南》（GB/T 35892—2018）進行飼養(yǎng)和處理。

1.2.2 組織學觀察

將固定于4%甲醛溶液中的十二指腸組織切片，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中，最后用蒸餾水洗至脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察組織切片并記錄組織學變化。

1.2.3 十二指腸抗氧化指標測定

將采集的十二指腸樣用于測定組織總抗氧能力（total antioxidant capacity,T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、GSH-Px、CAT活性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。所有指標均由北京華英生物技術研究所采用化學比色法檢測。

1.2.4 實時熒光聚合酶鏈式反應

采用Trizol法提取各腸組織樣總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。按照Toyobo反轉錄試劑盒（Toyobo biotech公司，日本）說明書將RNA反轉錄為cDNA。然后以cDNA為模板進行實時熒光聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）。采用Primer 5.0軟件設計引物序列（表1），由北京擎科生物技術有限公司合成。使用SYBR Green反應混合液試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）在LightCycler 96熒光定量PCR儀（Roche公司，瑞士）上進行反應。反應體系為:10 μL 2×AceQ熒光定量PCR SYBR Green反應混合液，上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，0.4 μL 50×ROX標準染料，100 ng cDNA模板，加ddH2O至20 μL。反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參基因，結果采用2－ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差表示，試驗采用Excel 2016作圖，采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析的鄧肯方法進行統(tǒng)計檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紹興鴨十二指腸組織病理學觀察

從圖1可以看出，對照組十二指腸呈現(xiàn)正常的組織結構（圖1A～E），而上籠應激后，隨著上籠應激時間的延長，十二指腸組織表現(xiàn)出一定的組織損傷（圖1F～J），特別是在上籠應激后期，即上籠后第4、7和10天，十二指腸組織出現(xiàn)腸腺上皮細胞脫落，并有較多的炎癥細胞浸潤，且隨著上籠時間的增加，腸腺上皮細胞脫落程度更加嚴重（圖1H～J）。

表1 RT-PCR引物信息Table 1 Information for RT-PCR primers

2.2 紹興鴨十二指腸組織抗氧化能力分析

籠養(yǎng)初期紹興鴨十二指腸抗氧化能力相關指標測定結果見圖2?？梢钥闯觯篗DA含量、T-AOC、SOD和GSH-Px活性隨上籠應激時間延長呈現(xiàn)波動性變化，且在上籠應激試驗后期，處理組MDA含量、SOD和T-AOC活性高于對照組，但除T-AOC外其余差異均不顯著（P＞0.05）；與對照組相比，十二指腸CAT活性隨著應激時間的延長呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢，且在上籠后第7天顯著增加（P＜0.05）。

2.3 上籠應激對紹興鴨十二指腸應激相關基因mRNA表達量的影響

由圖3可知：與對照組相比，上籠應激過程中處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關基因CHOP的mRNA水平呈現(xiàn)波動性變化（圖3A），且在上籠應激后第2和10天顯著增加（P＜0.05）；而處理組GRP78基因的mRNA相對表達水平在各時間點均高于對照組（圖3B），且在第2、7、10天顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.4 上籠應激對紹興鴨十二指腸凋亡相關基因mRNA表達量的影響

由圖4可以看出：較對照組而言，隨著上籠應激時間的延長，凋亡相關基因Bax的mRNA表達水平顯著增加（圖4A），特別是在上籠應激后第7和10天達到顯著水平（P＜0.05）；而半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（cysteinecontaining aspartate-specific proteases-3,Caspase3）的表達水平在兩組間無顯著變化（圖4B）。

2.5 上籠應激對紹興鴨十二指腸炎癥相關基因mRNA表達量的影響

由圖5可知：與對照組相比，隨著上籠應激時間的延長，炎癥相關基因環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）的mRNA表達量增加（圖5A），特別是在上籠應激后第10天時與對照組相比達到顯著水平（P＜0.05）。而一氧化氮合酶（inducible nitric oxide,iNOS）的mRNA表達量變化趨勢與COX-2不同：在上籠應激早期，試驗組iNOSmRNA表達量顯著低于對照組（P＜0.05），而在上籠應激后期，iNOSmRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.05）（圖5B）。

3 討論

3.1 上籠應激對紹興鴨十二指腸組織結構的影響

圖1 上籠應激對紹興鴨十二指腸組織結構的影響Fig.1 Effect of caged stress on the structure of duodenum in Shaoxing duck

十二指腸是消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和眾多消化酶活動的重要場所，所以良好的十二指腸結構和功能是保證動物正常生長和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的基本條件。本試驗研究了上籠應激對十二指腸組織結構的影響。與對照組相比，隨著上籠應激時間的延長，試驗組在上籠應激的后期，其組織結構受到一定程度的損傷。胡艷欣等[12]報道，熱應激導致豬十二指腸黏膜結構損傷嚴重，黏膜上皮出現(xiàn)大面積脫落并裸露固有層；寧章勇等[13]報道，當肉仔雞處于高溫條件下時，十二指腸出現(xiàn)明顯的病理損傷性變化，特別是在熱應激后期，肉仔雞腸上皮細胞嚴重脫落，腸絨毛斷裂，并出現(xiàn)黏膜固有層水腫。本試驗結果與上述研究結論有一致性。本試驗結果也顯示了在上籠應激過程中，對照組十二指腸表現(xiàn)出正常的組織結構，而上籠應激組在上籠后第4、7和10天出現(xiàn)腸腺上皮細胞變性，大面積脫落，并有較多的炎癥細胞浸潤。這表明上籠應激可導致十二指腸組織結構的改變，從而影響腸道的生理功能。

圖2 上籠應激對紹興鴨十二指腸抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of caged stress on the duodenal antioxidant capacity of Shaoxing duck

圖3 上籠應激對紹興鴨十二指腸應激相關基因mRNA表達量的影響Fig.3 Effect of caged stress on the mRNAexpression level of duodenal stress-related genes of Shaoxing duck

圖4 上籠應激對紹興鴨十二指腸凋亡相關基因mRNA表達量的影響Fig.4 Effect of caged stress on the mRNAexpression level of duodenal apoptosis-related genes of Shaoxing duck

圖5 上籠應激對紹興鴨十二指腸炎癥相關基因mRNA表達量的影響Fig.5 Effect of caged stress on the mRNAexpression level of duodenal inflammation-related genes of Shaoxing duck

3.2 上籠應激對紹興鴨十二指腸組織抗氧化能力的影響

動物在非生物或生物應激狀態(tài)下會產(chǎn)生各種有害的活性氧類（reactive oxygen species,ROS），如過氧化物、自由基和超氧化物。這些物質(zhì)過多的產(chǎn)生容易對機體組織細胞造成嚴重損傷并引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)被氧化、酶活被抑制等破壞生物機體正常現(xiàn)象的產(chǎn)生，從而導致細胞死亡[14-18]。動物在進化過程中對脂質(zhì)過氧化作用的損傷既能形成酶促抗氧化系統(tǒng)，又能生成非酶促抗氧化系統(tǒng)，且兩者可使機體在自由基的產(chǎn)生和消除中形成復雜的防御系統(tǒng)。SOD、GSH-Px、CAT作為抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員，是動物體內(nèi)抗氧化防御的第1道屏障，其含量可以反映對組織的損傷水平。MDA是評價脂質(zhì)過氧化水平的指標之一，其含量可反映氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化程度。T-AOC代表機體酶類和非酶類抗氧化機制的綜合效應，常用于衡量機體的抗氧化能力。呂朝輝[19]研究表明：急性、慢性冷應激可使雛雞十二指腸MDA含量明顯升高，說明冷應激使機體產(chǎn)生大量自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應；十二指腸SOD含量先降低后升高，表明雛雞由于應激產(chǎn)生大量的自由基，而SOD在清除自由基的同時又被消耗。曾濤[20]的研究結果也表明，熱應激使番鴨肝臟產(chǎn)生大量的ROS，從而增加了相關抗氧化酶SOD和CAT活性、T-AOC和MDA含量以消除過量的ROS。本試驗研究結果與上述一致。隨著上籠應激時間的增加，紹興鴨十二指腸SOD和GSH-Px活性、T-AOC和MDA含量上下波動，且在上籠應激前期SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量低于對照組，這可能由于急性上籠應激導致了紹興鴨體內(nèi)發(fā)生嚴重的生理代謝紊亂，機體需要適應一段時間來抵抗上籠應激環(huán)境造成的損傷。因此，本試驗結果表明，上籠應激能夠影響紹興鴨體內(nèi)自由基含量，從而使機體氧化與抗氧化作用失衡，進而改變紹興鴨抗氧化能力。

3.3 上籠應激對紹興鴨十二指腸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、炎癥及凋亡相關基因mRNA表達量的影響

氧化應激的發(fā)生導致活性氧和抗氧化能力之間的平衡遭到破壞，并通過各種信號傳導途徑（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應）引發(fā)細胞凋亡[21]。已有研究證實，GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生的標志之一，在參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7]。CHOP是GRP78下游重要的靶基因，同時也是介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡的重要成員之一。ALEMU等試驗結果表明，牛卵泡顆粒細胞處于高溫源下，GRP78的表達量上調(diào)，Bax的含量也隨之增加[22]。同時，SHAO等[23]的報道也證實，禽類肝細胞損傷時伴隨著GRP78蛋白高表達，表明GRP78蛋白參與組織損傷過程，而GRP78蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，影響著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白的折疊能力，GRP78在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應激時表達量增加。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導細胞凋亡過程中，鈣離子信號介導細胞凋亡是其主要機制之一，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高濃度的鈣離子是保證蛋白折疊的重要因素，如鈣離子大量排出，可誘導產(chǎn)生多種細胞凋亡信號，最終通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，而位于線粒體中的促凋亡蛋白Bax主要通過調(diào)控線粒體中鈣離子濃度來調(diào)節(jié)細胞凋亡，因此，細胞中Bax蛋白表達量增加[24]。本試驗結果表明，籠養(yǎng)應激導致十二指腸中CHOP和GRP78mRNA表達量增加，這表明十二指腸細胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，進而促進BaxmRNA的表達水平上升，最終導致細胞凋亡。

炎癥因子是應激反應引起動物組織損傷和宿主防御中的重要指標，而NF-κB信號轉導通路作為炎癥因子重要的作用途徑，存在于多種細胞增殖、凋亡和免疫等過程中[25]。iNOS和COX-2作為NF-κB信號通路中2種重要分子，兩者互相協(xié)調(diào)，是炎癥過程中關鍵的幾個基因，對激活NF-κB具有重要意義[26]。在本研究中，紹興鴨十二指腸組織中iNOSmRNA表達水平在上籠應激后期顯著上調(diào)，這可能是由于在上籠應激后，iNOS在炎癥過程中增加了組織中的一氧化氮合成，使紹興鴨體內(nèi)建立了主動的防御機制[27-28]。這與ZHANG等[29]的研究結果一致。同時，紹興鴨十二指腸組織COX-2mRNA的表達量在上籠應激第10天顯著上調(diào)，表明COX-2在上籠應激過程中有導致黏膜損傷、增強組織損傷和炎癥過程的作用[30]。此外，有研究表明，小鼠在氧化應激過程中可以通過NF-κB-iNOS信號通路來增加iNOS表達量，進而誘導細胞凋亡[31]。本研究中，隨著上籠應激時間的增加，NF-κB信號通路中的iNOS和COX-2mRNA表達水平也隨之顯著上調(diào)，BaxmRNA表達量也在上籠應激后期顯著上調(diào)。這表明應激過程中產(chǎn)生的大量活性氧和活性氮，通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關基因途徑誘導細胞凋亡，進而引起組織細胞損傷。由于家禽商業(yè)化抗體較少，且家禽與哺乳動物同源性較低，所以本試驗中上籠應激是否在蛋白水平對紹興鴨十二指腸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、炎癥及凋亡相關基因有影響還需進一步驗證。

總之，長期以來，以地面平養(yǎng)方式為主的蛋鴨養(yǎng)殖形成了其傳統(tǒng)的養(yǎng)殖模式。然而，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，國家相關法律對生物安全和產(chǎn)品品質(zhì)要求的提高，畜禽養(yǎng)殖環(huán)境的控制力度加大，土地水源使用率的提高以及勞動力成本的增加，傳統(tǒng)的蛋鴨養(yǎng)殖模式受到極大的限制，導致蛋鴨籠養(yǎng)這一新型養(yǎng)殖模式所占比例逐漸增加，并逐漸在全國范圍內(nèi)推廣開來。該方式不僅能夠有效降低蛋鴨養(yǎng)殖過程中造成的環(huán)境污染，降低疫病感染率，而且能夠通過標準化的生產(chǎn)程序，保障鴨蛋產(chǎn)品及食品安全，提升養(yǎng)殖效益，實現(xiàn)了提質(zhì)增效、減排降耗雙重效益。目前，蛋鴨籠養(yǎng)模式已在江蘇、浙江、河南等地實施并推廣應用。

4 結論

本研究表明，上籠應激能引起紹興鴨十二指腸的組織損傷，增加十二指腸的氧化應激損傷程度，并通過上調(diào)上籠應激誘導的十二指腸細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激強度和炎癥反應導致細胞凋亡的產(chǎn)生。