張 思，沈靜茹，陸金富，覃信銘

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

羥丙哌嗪(Dropropizine)是一種通過作用于外周受體及其傳入導(dǎo)體來抑制咳嗽反射的外周性鎮(zhèn)咳藥[1]。1988年由意大利 Dompe'Farm S.P.A公司研發(fā)上市[2]，它以外消旋形式或其純對(duì)映體銷售，兩者在世界范圍內(nèi)都以各種藥物劑型(例如片劑，糖漿和口服溶液)獲得，由于優(yōu)良的藥效性得到廣泛應(yīng)用[3]。純左旋對(duì)映體的鎮(zhèn)咳效果與外消旋羥丙哌嗪相當(dāng)，但中樞鎮(zhèn)靜反應(yīng)明顯降低，且無藥物依賴性，羥丙哌嗪的藥物副作用主要來源于其右消旋體[4]。因此，有必要開發(fā)簡(jiǎn)單、高效的方法分離測(cè)定手性藥物羥丙哌嗪。

目前，主要有高效液相色譜法(HPLC)實(shí)現(xiàn)羥丙哌嗪?jiǎn)我粚?duì)映體的分析測(cè)定。Balaji等[5]從大鼠血漿中提取出羥丙哌嗪異構(gòu)體，在甲醇和二乙胺為流動(dòng)相的Chiralpak IG-3色譜柱上直接分離左羥丙哌嗪和右羥丙哌嗪，分離度Rs達(dá)到 4.45。黃勇等[6]在Chiracel-OC手性柱正相模式下，拆分了羥丙哌嗪對(duì)映體酯化產(chǎn)物，但未能實(shí)現(xiàn)羥丙哌嗪的直接分離。與HPLC相比，高效毛細(xì)管電泳(HPCE)具有靈敏度高、分辨率高和成本低等特點(diǎn)，已成為對(duì)映體分離領(lǐng)域的有力手段。衍生化的β-環(huán)糊精(CD)是目前研究最廣泛的手性HPCE拆分的選擇劑之一，其中有些β-CD衍生物與手性分子相互作用較強(qiáng)，由于靜電相互作用易于形成包合，顯現(xiàn)出較好的對(duì)映體選擇性。論文采用組氨酸-β-環(huán)糊精(β-CD-E2)衍生物制成HPCE手性整體柱并用于羥丙哌嗪消旋體的手性拆分，優(yōu)化了拆分條件后構(gòu)建了羥丙哌嗪對(duì)映體手性拆分的HPCE新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

負(fù)電源高效毛細(xì)管電泳儀(CL1020，北京彩陸科學(xué)儀器有限公司)，自動(dòng)電位pH滴定計(jì)(ZD-2型，上海偉業(yè)儀器廠)，微孔濾膜(0.22 μm，津騰歐美國(guó)家進(jìn)口膜)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，陶氏化學(xué)公司)，一水合檸檬酸、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和檸檬酸三鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(H3PO4，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，羥丙哌嗪標(biāo)準(zhǔn)品(98.5%，阿拉丁試劑)，β-CD-E2毛細(xì)管整體柱(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 電泳條件

用于測(cè)定目標(biāo)化合物的波長(zhǎng)為254 nm，在制備的毛細(xì)管整體柱(有效長(zhǎng)度40 cm×φ75 μm)上進(jìn)行樣品分析。首次使用整體柱用HCl和水各沖洗30 min，每次在開始實(shí)驗(yàn)之前，毛細(xì)管整體柱用水沖洗10 min，用背景電解質(zhì)(BGE)加電場(chǎng)處理30 min。羥丙哌嗪樣品在手動(dòng)壓力下進(jìn)樣20 s，采用負(fù)電源模式，對(duì)樣品進(jìn)行分離分析。所有溶液均經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 探究緩沖體系對(duì)羥丙哌嗪對(duì)映體分離的影響

電泳儀上設(shè)置電壓-20 kV，背景緩沖液pH值4.00，濃度50 mmol/L，手動(dòng)進(jìn)樣20 s，羥丙哌嗪濃度2.0×10-5mol/L的條件下，通過改變緩沖液種類，探究了Tris-H3PO4，檸檬酸三鈉-檸檬酸，Tris-檸檬酸以及Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系對(duì)β-CD-E2整體柱拆分羥丙哌嗪消旋體的洗脫能力。

結(jié)果表明，不同的緩沖體系與樣品分子的相互作用力有差異，影響著電滲流的平衡，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的洗脫能力。在pH值4.00條件下，檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液對(duì)羥丙哌嗪的洗脫能力最弱，Tris-檸檬酸緩沖液對(duì)樣品分子幾乎不具有對(duì)映體選擇性，Tris- H3PO4和Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對(duì)羥丙哌嗪消旋體都具有一定的手性識(shí)別能力，且Na2HPO4-檸檬酸的洗脫能力更強(qiáng)。因此，選用Na2HPO4-檸檬酸作為羥丙哌嗪手性拆分的最佳緩沖體系。

2.2 探究緩沖液pH值對(duì)羥丙哌嗪對(duì)映體分離的影響

在制備的β-CD-E2整體柱上，選擇Na2HPO4-檸檬酸作為流動(dòng)相，濃度30 mmol/L，其他條件同2.1，通過改變緩沖液pH值，使其為3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00，分別考察了pH值對(duì)羥丙哌嗪消旋體拆分的影響，部分拆分結(jié)果如圖1所示。

圖1 緩沖液pH值對(duì)羥丙哌嗪對(duì)映體分離的影響
Fig.1 Effect of buffer pH on the enantioseparation of dropropizine

結(jié)果表明，緩沖液的pH不僅能夠影響固定相和分析物的表觀電荷，而且影響柱內(nèi)電滲流(EOF)的平衡，進(jìn)而影響樣品分子的分離。pH值在3.50～6.00范圍內(nèi)，β-CD-E2整體柱分離羥丙哌嗪均能達(dá)到基線分離。pH值3.50～5.00時(shí)，背景緩沖液酸度減小，毛細(xì)管內(nèi)壁EOF增大，樣品分子的遷移時(shí)間隨pH值增大而減小；但是pH值5.00～6.00時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)壁電荷密度隨pH值而增大，影響復(fù)合物的解離狀態(tài)，導(dǎo)致羥丙哌嗪對(duì)映體的分析時(shí)間又會(huì)逐漸增大；pH值6.00～7.00范圍內(nèi)，此時(shí)電解質(zhì)接近中性，影響了β-CD-E2固定相對(duì)羥丙哌嗪的有效手性識(shí)別能力，不利于樣品分子的洗脫。綜合考慮羥丙哌嗪兩對(duì)映體的分析時(shí)間和洗脫強(qiáng)度，選擇5.00為羥丙哌嗪分離的最佳pH值。

2.3 探究羥丙哌嗪對(duì)映體分離的線性范圍

在選擇性優(yōu)化條件下(檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，分離電壓-20 kV，Na2HPO4-檸檬酸 pH值5.00，濃度30 mmol/L，手動(dòng)進(jìn)樣20 s)，用羥丙哌嗪消旋體標(biāo)準(zhǔn)品配制了不同濃度的溶液，探究了β-CD-E2整體柱分離羥丙哌嗪對(duì)映體的線性范圍。結(jié)果表明，在9.8×10-6～2.0×10-5mol/L范圍內(nèi)，羥丙哌嗪濃度與兩對(duì)映體峰高、峰面積呈一定的線性相關(guān)。

3 結(jié)語

本研究利用β-CD-E2作為手性固定相制備的HPCE整體柱拆分了手性藥物羥丙哌嗪，通過對(duì)緩沖體系、緩沖液pH值等分離條件的選擇優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了羥丙哌嗪8 min內(nèi)的快速分離。在檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，30 mmol/L pH值5.00的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，樣品濃度2.0×10-5mol/L，電壓-20 kV，手動(dòng)進(jìn)樣20 s的最佳分離條件下，羥丙哌嗪對(duì)映體的分離度Rs達(dá)到40.52，分離結(jié)果優(yōu)于已有文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道結(jié)果。這說明，經(jīng)過衍生后的β-CD分子內(nèi)部既存在疏水空腔，同時(shí)又帶有羧基、氨基基團(tuán)。羥丙哌嗪結(jié)構(gòu)中的羥基易與β-CD-E2中氨基、羧基產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電相互作用、氫鍵作用以及偶極偶極相互作用從而表現(xiàn)出良好的對(duì)映體選擇性。本研究為手性藥物羥丙哌嗪建立了一種新的HPCE分離分析體系。

感謝中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CZY19037)的資助。