鄭 立，耿紅梅

(1.衡水市疾病預(yù)防控制中心，河北 衡水 053000；2.衡水學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，河北 衡水 053000)

大孔吸附樹脂比表面積大、交換速度快、吸附選擇性較高，不溶于酸、堿及有機溶劑，是一類比較環(huán)保的高聚物。大孔吸附樹脂吸附法與溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、膜分離法等分離技術(shù)相比，具有生產(chǎn)周期短、可重復(fù)使用樹脂等優(yōu)點，在化合物的分離中被廣泛應(yīng)用[1-2]。皂角刺為豆科皂莢屬植物皂莢(Gleditsia sinensis Lam)的干燥棘刺，始載于《本草綱目》，2015版藥典記載具“消腫托毒、排膿、殺蟲的功效，用于癰疽初起或膿成不潰、外治疥癬麻風(fēng)”[3]。研究表明，皂角刺含有黃酮類化合物、三萜、多糖等等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、護肝等多種藥理作用，臨床常用于治療癌癥。皂角刺黃酮類成分是天然抗氧化劑，具較強的清除自由基的能力[4-6]。目前，國外關(guān)于皂角刺的研究很少，國內(nèi)大部分研究僅限于鑒定和功效的研究[7-11]，劉愛朋等研究了皂角刺總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性[12]，但有關(guān)大孔樹脂純化皂角刺總黃酮的研究未見報道。本實驗選取多種不同型號的大孔吸附樹脂，考察它們的吸附與解吸性能，選出對皂角刺總黃酮具有較好吸附分離性能的樹脂，并優(yōu)化其工藝參數(shù)，以期為皂角刺資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

TU-1901紫外可見分光光度計(普析通用儀器公司)；THZ-82恒溫振蕩器(金壇市富華儀器有限公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；W-201B數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù))；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器)；FA2004N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；各種型號標(biāo)準(zhǔn)口玻璃儀器(天津玻璃儀器廠)。

皂角刺購于河北安國藥材市場，經(jīng)衡水市藥檢所孫雪主任藥師鑒定為豆科植物皂角刺；SP700大孔吸附樹脂(日本三菱化學(xué)公司)、AB-8、D101、S-8、D4020、NKA-9、X-5、NKA大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠)；蘆丁對照品(購于中國藥品生物制品檢定所)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 上樣液制備

稱取皂角刺粉末適量，加水10倍量浸泡過夜，放入索氏提取器中，采用索氏提取裝置用70%乙醇溶液提取至無色，最后得到生藥溶液0.2 g/mL，備用。

2.2 皂角刺總黃酮測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]

將蘆丁對照品干燥至恒重，精稱17.11 mg，于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得(每1 mL溶液中含蘆丁0.171 mg)。分別用移液管精密量取該溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于10 mL量瓶中，加0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放6 min；加0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，放6 min；再加4.0 mL的10%氫氧化鈉溶液，用70%乙醇定容，搖勻，放15 min。以0.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液做空白，波長為510 nm，測吸光度。以蘆丁濃度(X)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=13.2X-0.0003，r=0.9996，線性范圍為17.1～85.5 μg/mL。

2.2.2 測定方法

精密量取供試品溶液0.4 mL，置10 mL量瓶中，照2.2.1項下的方法操作，在分光光度計上，在510 nm波長處測定吸光度A，平行測三次，計算總黃酮的含量為4.37%。

2.3 樹脂型號的篩選研究

2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理及含水量的測定

選用多種不同型號的大孔吸附樹脂進行試驗(SP700、NKA-9、AB-8、X-5、S-8、NKA、D4020)。將樹脂先用95%乙醇浸泡24 h，裝柱后用蒸餾水洗，再用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡 2 h后，用水洗至pH值約為7，再用0.1 mol/L 鹽酸溶液浸泡2 h后，用水洗至pH值約為7，最后用95%和蒸餾水洗至無醇，備用。取少量樹脂，用干燥法測定含水量(見表1)。

2.3.2 靜態(tài)吸附-解吸試驗

取上述不同型號(SP700、X-5、S-8、NKA、NKA-9、AB-8、D4020)經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂各1.0 g，放于具塞三角瓶中，加入25.00 mL吸附原液，在恒溫振蕩器上振蕩24 h，吸附后過濾，續(xù)濾液用上述方法測定總黃酮的含量。并計算關(guān)于皂角刺總黃酮不同樹脂的靜態(tài)吸附率、吸附量。結(jié)果見表1。同時，取上述不同型號已經(jīng)吸附飽和后的樹脂，均加70%乙醇 25 mL，于恒溫振蕩器上，20℃振蕩12 h，過濾后測定濾液中總黃酮含量，計算出解吸率。

吸附量 =(吸附前溶液濃度-吸附后溶液的平衡濃度)×溶液體積/干樹脂重量

吸附率(%)=(吸附前溶液濃度-吸附后溶液的平衡濃度)/吸附前溶液濃度×100

解吸率(%)= 濾液中總黃酮的含量×濾液的體積/樹脂的飽和吸附量×100

表1 7種樹脂的靜態(tài)吸附和解吸性能

結(jié)果表明：7種不同型號樹脂種，SP700、S-8、AB-8的吸附容量較大，SP700、AB-8、X-5的解吸率較大。

2.3.3 靜態(tài)吸附曲線的繪制

照2.3.2測定法，分別在吸附1、2、3、4、6、8、10 h，測定各樹脂對總黃酮的吸附量Qt(mg/g)，以 Qt為縱坐標(biāo)，以時間t為橫坐標(biāo)，作圖，得曲線，結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，SP700、AB-8、S-8型的樹脂吸附性能較好。

2.4 AB-8樹脂純化皂角刺總黃酮的工藝參數(shù)考察[10]

2.4.1 上樣濃度的確定

分別取0.1、0.2、0.3、0.4 g/mL的溶液10 mL，通過裝有20 mL AB-8大孔樹脂柱，流速2 mL/min，進行一次重復(fù)吸附，吸附完全后，先用蒸餾水將未吸附樣品液洗凈，再用70%乙醇洗至洗脫液中基本無黃酮。將洗脫液濃縮定容至100 mL進行測定，計算總黃酮吸附量，分別為6.33、9.52、8.98、9.12(mg總黃酮/mL樹脂)，故上樣液濃度選擇0.2 g/mL。

2.4.2 洗脫劑的確定

取10 mL的濃度為0.2 g/mL的樣品液，流速2 mL/min，分別通過AB-8樹脂柱4支，均上樣后進行動態(tài)吸附。先用蒸餾水洗脫樹脂柱，至洗脫液接近無色，然后分別用30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，最后至洗脫液中基本無黃酮，將洗脫液進行收集，測定總黃酮的含量，并將洗脫液蒸干、稱重，計算總黃酮回收率，結(jié)果見表2。從表可以看出，70% 乙醇洗脫物中,總黃酮回收率最高，故確定70% 乙醇為最佳洗脫劑。

表2 不同洗脫劑對皂角刺總黃酮的影響

2.4.3 吸附流速的確定

取濃度為0.2 g/mL的樣品溶液10 mL，分別以1、2、3 mL/min的流速通過裝有20 mL的AB-8大孔樹脂柱進行吸附，考察流速對樹脂吸附量的影響。結(jié)果表明，吸附流速過快，樹脂吸附量下降，提前泄漏；流速低，有利于黃酮的充分吸附，但會影響生產(chǎn)效率，使生產(chǎn)周期延長，成本增加。綜合考慮，選擇吸附流速為2 mL/min較為適宜。

2.4.4 洗脫流速的確定

取濃度為0.2 g/mL的樣品溶液10 mL，以2 mL/min流速在3支AB-8樹脂柱進行上樣，用70%乙醇分別以1、2、3、4 mL/min的速度洗脫，將收集到的洗脫液干，稱重，計算總黃酮的回收率分別為72.1%、72.0%、69.6%、62.8%，故確定洗脫速度為2 mL/min。

2.4.5 樹脂重復(fù)利用次數(shù)的選擇

按照上面選定的條件：上樣濃度0.2 mg/mL，流速2 mL/min，用70%乙醇進行洗脫，洗脫流速2 mL/min，在同一個樹脂柱上，進行上樣、吸附、洗脫、收集，然后測定總黃酮的吸附量，重復(fù)試驗6次考察樹脂的情況。結(jié)果重復(fù)使用至第4次時，總黃酮收率明顯減低，樹脂顏色變綠明顯，需要進行再生處理。故樹脂可重復(fù)利用3次。

3 討論

從七種大孔吸附樹脂對皂角刺總黃酮的吸附容量、吸附率、解吸率、吸附動力學(xué)曲線等研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的樹脂對皂角刺總黃酮的吸附能力和解吸能力各有差別，測定的SP700型樹脂的吸附容量較大，而且也容易解吸，理論上是一種性能特別好的大孔樹脂，但它屬于進口產(chǎn)品價格較貴。而AB-8大孔吸附樹脂的分離效果也比較好，國內(nèi)生產(chǎn)，AB-8大孔吸附樹脂在實際生產(chǎn)種使用較多?；诖朔N情況，我們選擇AB-8大孔樹脂來分離皂角刺總黃酮。從七種大孔吸附樹脂對皂角刺總黃酮的吸附容量、吸附率、解吸率、吸附動力學(xué)曲線等研究通過實驗確定AB-8樹脂純化皂角刺總黃酮的條件為：供試液的上樣濃度為0.2 mg/mL，用2 mL/min流速緩慢上樣，以70%乙醇進行洗脫，洗脫流速為2 mL/min，樹脂可重復(fù)利用三次。在此條件下，用AB-8大孔吸附樹脂分離皂角刺中總黃酮，總黃酮的回收率可為82.8%。實驗結(jié)果表明經(jīng)過分離純化濃縮干燥后，制得樣品中總黃酮含量由4.37%提高至62.5%。該研究為皂角刺總黃酮的純化提供實驗方法,為進一步開發(fā)皂角刺有效部位新藥提供參考。