陳明成,賈洪濤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)湖北醫(yī)藥學(xué)院研究生培養(yǎng)基地,湖北 十堰,442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院 泌尿外科,湖北 十堰,442000)

約90%的腎惡性腫瘤是腎細(xì)胞癌(RCC)。RCC轉(zhuǎn)移潛力高,10%～20%的病例在診斷時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,20%～30%在術(shù)后隨訪期間發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。透明細(xì)胞RCC(ccRCC)是最常見的組織學(xué)亞型[2]。隨著靶向療法的改進(jìn)，轉(zhuǎn)移性ccRCC患者預(yù)后明顯改善，但仍有多數(shù)患者出現(xiàn)耐藥性[3]。研究[4]表明，微小RNA(miRNA)是脊椎動(dòng)物蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)器，是生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)、組織發(fā)育和維持組織特定功能等基本生物過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。研究[5]發(fā)現(xiàn),miRNA平均半衰期為119 h(約5 d)。研究[6-7]表明，循環(huán)miRNA或可用于檢測(cè)各種不同類型的癌癥，并指導(dǎo)治療干預(yù)[7]。牛少曦等[8]研究表明,miR-223與ccRCC的增殖及遷移可能有相關(guān)性。多項(xiàng)研究[9-11]表明,miR-223在急性腦梗死、強(qiáng)直性脊柱炎、胃惡性腫瘤患者外周血中表達(dá)異常。本研究探討血漿miR-223在ccRCC患者外周血中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月—2019年7月十堰市人民醫(yī)院40例診斷為ccRCC患者的術(shù)前及術(shù)后7 d(miRNA半衰期約為119 h)外周血漿標(biāo)本設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，其中女14例，男26例;年齡54～76歲;TNM分期包括Ⅰ期6例,Ⅱ期13例,Ⅲ期14例,Ⅳ期7例。選取2017年8月—2019年7月十堰市人民醫(yī)院門診體檢的80例健康志愿者外周血液標(biāo)本設(shè)為對(duì)照組，其中男50例，女30例，年齡50～70歲。2組均抽取靜脈無菌血樣，經(jīng)過靜置離心后取上清，保存于-80 ℃冰箱中。標(biāo)本獲取得到受試者本人知情同意，本院倫理審查委員會(huì)已審查通過。

1.2 方法

1.2.1 提取血樣總RNA進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄:首先從-80 ℃冰箱中抽取實(shí)驗(yàn)所需的血樣，根據(jù)RNA提取試劑盒的說明，使用Qiagen RNeasy lipid mini kit試劑盒提取血液樣品中的總RNA,采用紫外分光光度法測(cè)定提取物的純度和濃度。分別加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、RNA 酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄特異引物，使用Taqman miRNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。逆轉(zhuǎn)錄特異引物序列為:CTCACAGTACGTTGGTATCCTTGTGATGTT

TCGATGCCATATTGTACTGTGAGTGGGGTAT。反應(yīng)條件依次為16 ℃下30 min,40 ℃下30 min,80 ℃下6 min。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血樣miR-223表達(dá)量:按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書，使用ABI7500 PCR 儀進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，以u(píng)6作為對(duì)照，對(duì)樣品中的miR-223的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。u6引物序列為:上游引物5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下游引物5′-AAGGAAGCGCTGGATG-3′。反應(yīng)條件依次為95 ℃變性60 s,55 ℃變性10 s,55 ℃變性10 s。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)所得的CT值得出ccRCC患者術(shù)前血漿、ccRCC患者術(shù)后血漿、健康人群外周血漿中miR-223的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。miR-223相對(duì)水平以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較行t檢驗(yàn)。采用Spearman法分析miR-223在外周血中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)外周血中的miR-223表達(dá)水平診斷ccRCC的價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組外周血漿中miR-223的表達(dá)

利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)得2組外周血漿中miR-223的表達(dá)量,ccRCC患者術(shù)前外周血中miR-223的表達(dá)量為(0.568±0.047),高于健康人群的(0.231±0.037),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ccRCC患者術(shù)后7 d外周血中miR-223的表達(dá)量為(0.324±0.041),較術(shù)前外周血中miR-223表達(dá)量降低，但仍高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 ccRCC患者外周血中miR-223的表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系

結(jié)果顯示,miR-223在外周血中的表達(dá)與腫瘤TNM分期、腫瘤大小、腫瘤分化程度有顯著相關(guān)性(P<0.05),與年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 ccRCC患者外周血中miR-223的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

與同一指標(biāo)另一亞項(xiàng)比較,*P<0.05。

2.3 外周血中miR-223的表達(dá)診斷ccRCC的臨床價(jià)值

外周血中miR-223的表達(dá)在區(qū)分ccRCC患者和健康人群中具有較高診斷價(jià)值，其ROC曲線下面積為0.893,對(duì)ccRCC的診斷具有較高的敏感度和特異度。見圖1。

圖1 miR-223診斷ccRCC的ROC曲線分析

3 討 論

研究[12]發(fā)現(xiàn),ccRCC在腎臟近端小管中發(fā)展，與馮希佩爾-林道(VHL)腫瘤抑制基因的雙發(fā)失活有關(guān)。VHL綜合征是由VHL基因的生殖系點(diǎn)突變引起的遺傳性疾病，其特征是各種良性和惡性腫瘤的易感性。根據(jù)患者的基因型,VHL綜合征可分為4個(gè)亞型(1、2A、2B和2C),只有1和2B亞型患者易患ccRCC。

研究認(rèn)為,miRNA與癌癥形成和進(jìn)展高度相關(guān),miRNA通過在特異性mRNA的3′未翻譯區(qū)域內(nèi)進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)來發(fā)揮生物功能，這通常通過mRNA降解或轉(zhuǎn)化抑制的方式導(dǎo)致靶基因表達(dá)的降低。研究[13]表明,miRNA在正常組織和癌癥組織之間表達(dá)不同，并且這種表達(dá)在不同的癌癥類型之間也存在差異。研究[14]證實(shí)，循環(huán)miRNA或可用于檢測(cè)各種不同類型的癌癥，并指導(dǎo)治療干預(yù)。研究[15-17]表明,miR-223在多種人類癌癥中具有上調(diào)作用，包括結(jié)腸直腸癌、肺癌和胃癌。本研究發(fā)現(xiàn),ccRCC患者術(shù)前外周血中miR-223的表達(dá)量顯著高于健康人群，患者術(shù)后7 d外周血中miR-223的表達(dá)量仍高于健康人群，但較術(shù)前已顯著降低;同時(shí),miR-223在外周血中的表達(dá)與腫瘤TNM分期、腫瘤大小、腫瘤分化程度有顯著相關(guān)性(P<0.05),與年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性(P>0.05)。本研究還顯示,miR-223的ROC曲線下面積為0.964,提示外周血中miR-223的表達(dá)在區(qū)分ccRCC患者和健康人群中具有較高診斷價(jià)值，對(duì)ccRCC的診斷具有較高的敏感度和特異度。

綜上所述,miR-223或可成為診斷ccRCC的血清生物學(xué)標(biāo)志之一，且與腫瘤的臨床病理特征有一定相關(guān)性，對(duì)患者術(shù)后的復(fù)查及預(yù)后判斷亦有一定的價(jià)值。