李 玥，李成成，李 靜，張瀟月，張紫薇，黃議漫，劉 浩，羅 鴻，張小平，趙 珂*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100094；3.旺蒼縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 廣元628200；4.瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，四川 瀘州 646000）

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，大量畜禽排泄廢物已經(jīng)成為主要的環(huán)境污染源[1-2]。畜禽養(yǎng)殖業(yè)所產(chǎn)生的大量固體廢棄物和廢水，已經(jīng)對我們?nèi)粘５纳a(chǎn)生活造成了不可忽視的影響。目前畜禽排泄物處理的方法主要有好氧堆肥發(fā)酵、厭氧消化法和烘干法等，處理后的畜禽排泄物惡臭氣體排放量明顯減少，并且大部分成為肥料和飼料資源。但由于畜禽排泄物成分復(fù)雜、處理周期長，在處理過程中也會產(chǎn)生大量的臭氣，主要成分有氨、硫化物、胺類和一些低級脂肪酸類等化學(xué)物質(zhì)[3]，其中濃度最高、影響最大的是氨和硫化氫，這兩種氣體進(jìn)入大氣后不僅會引起一系列環(huán)境問題，同時產(chǎn)生的刺激性氣味也會對人和家畜的健康造成極大危害[4-6]。

在各種畜禽排泄物中，雞糞由于其強(qiáng)烈的惡臭而比豬糞、牛糞等危害更大、更難處理。未腐熟的雞糞或在腐熟過程中產(chǎn)生的惡臭氣味，是由糞便里的甲硫醇、硫化氫、氨、吲哚和丙烯醛等10 多種物質(zhì)混合造成的[7]。雞糞產(chǎn)生的強(qiáng)烈惡臭不僅污染環(huán)境，危害人畜健康，也嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，因而引起公眾的極大關(guān)注。因此，減少雞糞中惡臭物質(zhì)的釋放對解決雞糞污染尤為重要。

研究表明，采用化學(xué)、物理及生物方法處理臭氣有一定效果，但化學(xué)和物理方法除臭可能造成二次污染，且處理費用頗高，大面積使用效果不理想，多見于化工業(yè)。微生物除臭的生物處理方法具有無二次污染、處理方式溫和、能耗低等特點，被廣泛應(yīng)用于畜禽排泄物的無害化處理，且處理效果顯著[2，8]，在國外已有較多的研究和應(yīng)用[9]。因此，以微生物為主的生物處理方法已成為固廢資源化的重要途徑，而微生物除臭法也成為堆肥除臭的有效方法和研究熱點。然而，受環(huán)境因素、畜禽排泄物來源及微生物特異性等因素影響，單一微生物很難高效除臭。研究表明，多種除臭菌混合培養(yǎng)后，各菌株相互協(xié)同作用更有利于臭氣的分解，增強(qiáng)除臭效果[10-11]。而目前我國有關(guān)選育和復(fù)配微生物除臭劑的研究報道還較少[12-13]。因此，本研究以雞糞堆肥為材料，從中分離篩選出具有除臭效率高、生長能力強(qiáng)的高效除臭菌株，并構(gòu)建復(fù)合菌系，旨在為畜禽糞便特別是雞糞的資源化和無害化處理提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

采集發(fā)酵前期、中期、后期3 個階段的雞糞堆肥樣品裝于無菌采樣袋中，封口并貼上標(biāo)簽。將裝有樣品的采樣袋置于冰盒中，帶回實驗室置于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基。含氮富集液體培養(yǎng)基N1[5]：蔗糖 25 g，NH4NO32 g，KH2PO42 g，NaCl 2 g，F(xiàn)eSO40.1 g，CaCl20.5 g，ZnSO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水950 mL，滅菌后的雞糞浸出液50 mL，pH 7.5～8.0。

（2）純化保種培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基[14]。

（3）篩選培養(yǎng)基。剛果紅培養(yǎng)基[15]：CMC-Na 2 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，（NH4）2SO41 g，剛果紅0.1 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水1000 mL；產(chǎn)氣檢測培養(yǎng)基L1：蔗糖2 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5～7.0。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取5 g 新鮮樣品置于帶有玻璃珠且裝有45 mL無菌水的三角瓶中，放于28 ℃恒溫?fù)u床室振蕩30 min 后，取 1 mL 接入 50 mL 富氮液體培養(yǎng)基 N1 中進(jìn)行富集培養(yǎng)，3 d 后再轉(zhuǎn)接到新鮮的N1 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。

1.2.2 分離純化菌種

將新鮮樣品和富集后的溶液進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋濃度為 10-4、10-5、10-6的培養(yǎng)液 0.1 mL 涂布于LB 培養(yǎng)基上，于28 ℃和45 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待菌長出后挑取單個菌落在LB 培養(yǎng)基上純化保種，于4 ℃冰箱保藏。

1.2.3 除臭微生物的初篩

（1）產(chǎn)氣篩選

將純化后的菌株接種在產(chǎn)氣檢測培養(yǎng)基L1 上，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱擴(kuò)培，待菌長出后，小心將濕潤的紅色石蕊試紙、醋酸鉛試紙插入培養(yǎng)皿內(nèi)讓其貼在皿蓋，3～5 min后觀察試紙是否發(fā)生顏色變化，菌株生長過程中產(chǎn)生氨紅色石蕊試紙將變?yōu)樗{(lán)色，產(chǎn)生硫化氫氣體醋酸鉛試紙將變?yōu)楹谏玔8]。

（2）除氨檢測

將不產(chǎn)生氨和硫化氫氣體的菌株在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培3 d 制成菌懸液，取10 mL 接入100 g 新鮮雞糞中；將此雞糞放入2 L 的密閉塑料罐，并在罐中放入1 個裝有30 mL 1 mol·L-1稀硫酸溶液的小燒杯，以此吸收雞糞產(chǎn)生的氨；空白對照組是將菌懸液換為10 mL 無菌水，每處理分別設(shè)置3 個平行。將此裝置放置在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 d 后，用凱氏定氮法測定吸收液中吸收氨的量[1，16]。按下述公式計算其除氨率。

式中：CNH3空為空白組氨的含量，CNH3處為處理組氨的含量，mg·L-1；c為硫酸溶液摩爾濃度，mol·L-1；v為消耗硫酸溶液的體積，mL；17為氨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，g·mol-1；V為2%硼酸吸收液體積，mL。

（3）除硫化氫檢測

將上述除氨檢測中所用菌懸液，取10 mL 接入100 g新鮮雞糞中；將此雞糞放入2 L的不透光密閉塑料罐，并在罐中放入1個裝有30 mL 1 mol·L-1堿性鋅銨絡(luò)溶液的小燒杯，以此吸收雞糞產(chǎn)生的硫化氫氣體；空白對照組是將菌懸液換為10 mL 無菌水，每處理分別設(shè)置3 個平行。將此裝置放置在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，用亞甲基藍(lán)分光光度法測定吸收液中硫化氫的含量[13]。按下述公式計算除硫化氫率。

式中：CH2S為空白組硫化氫的含量，CH2S處為處理組硫化氫的含量，mg·m-3；A為樣品顯色液吸光度；A0為空白溶液吸光度；BS為計算因子，斜率的倒數(shù)，μg·吸光度-1；VS換算成標(biāo)準(zhǔn)狀況下的采樣體積，L。

1.2.4 除臭菌株的復(fù)篩

將上述初篩獲得的同時具有除氨和除硫化氫能力的菌株于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d。取10 mL 菌懸液接入裝有100 g新鮮雞糞的2 L塑料罐中，并將吸收液，即裝有30 mL 1 mol·L-1稀硫酸溶液的小燒杯和裝有30 mL 1 mol·L-1堿性鋅銨絡(luò)溶液的小燒杯同時放入塑料罐中，密封好后放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出吸收液，同時放置新的吸收液，將取出的吸收液分別測定其吸收的氨或硫化氫氣體含量，連續(xù)測定 10 d[1，13]。

1.2.5 纖維素降解實驗

將初篩獲得的效果較好的菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后觀察其菌落周圍是否產(chǎn)生水解圈，并測量水解圈的直徑[15]，同時參照李靜等[15]的實驗方法定量測定各菌株的羧甲基纖維素酶（CMCase）活性，設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.6 除臭菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

對篩選出具有除臭效果的菌株進(jìn)行DNA 提取，采用 16S rRNA 基因序列通用引物 Eubac 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和Eubac 1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[17-18]對 DNA 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過Blast 軟件與Genbank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)Blast軟件的結(jié)果，選擇與目標(biāo)菌株同源性較高的菌株的16S rRNA 序列，用MEGA 6.0 軟件通過鄰近法構(gòu)建目標(biāo)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其種屬。

1.2.7 拮抗實驗

將篩選出具有除臭效果的菌株分別均勻地涂布于固體培養(yǎng)基上，待菌長滿平板后，用5 mm的無菌打孔器取下菌餅，將菌餅倒置于剛均勻涂布有另一菌液的平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，待另一種菌完全長出后觀察是否有拮抗現(xiàn)象[19]。

1.2.8 除臭菌系的構(gòu)建

根據(jù)各菌株的除臭效果，結(jié)合拮抗實驗結(jié)果，構(gòu)建復(fù)合菌系。將各組合菌株的菌懸液按照體積比1∶1混合后，按上述除臭檢測步驟測定各組合菌株的除臭能力，篩選出除臭效果好的復(fù)合菌系。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)通過 SPSS 20.0 軟件（SPSS Inc.，Chica?go，US）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與產(chǎn)氣篩選

本研究從不同處理時期的雞糞堆肥中共分離獲得200 株菌株，其中細(xì)菌146 株，真菌54 株。試紙檢測結(jié)果表明，200株菌僅有15株不產(chǎn)生氨和硫化氫氣體，其中細(xì)菌10 株（MS03、MS07、MS11、MS42、MS51、MS60、MS61、MS82、MS88 和 MS92），真菌 5 株（Z14、Z24、Z26、Z35和Z38）。

2.2 除臭檢測

對篩選獲得的不產(chǎn)生惡臭氣體的15 株菌進(jìn)行除氨、除硫化氫能力的檢測。結(jié)果顯示除菌株MS88 以外，其余14株菌對氨或硫化氫氣體均有一定的去除能力，但各菌株對兩種惡臭氣體的去除效果有較大差異，除臭率表現(xiàn)為除硫化氫率大于除氨率，而兩種氣體的減少量則表現(xiàn)為氨氣遠(yuǎn)高于硫化氫氣體（表1）。

2.3 除臭菌復(fù)篩

為了進(jìn)一步明確除臭菌株的除臭能力，本研究連續(xù)10 d 對初篩中除臭效果較好的5 株菌（MS03、MS07、MS11、MS42、MS82）分別進(jìn)行氨及硫化氫釋放量的測定。結(jié)果表明，各菌株氨和硫化氫釋放量均明顯低于CK。說明這5 株菌均有較好抑制雞糞在發(fā)酵過程中釋放惡臭氣體的能力，但各菌株在雞糞發(fā)酵過程抑制氨和硫化氫釋放作用中存在差異（圖1）。菌株MS03 和菌株MS07 對氨和硫化氫的抑制量表現(xiàn)出與初篩較為一致的結(jié)果，這兩株菌對氨和硫化氫的抑制量均較高，并且在接種第6 d 后氨和硫化氫的釋放量均呈現(xiàn)出明顯下降后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)，菌株MS11、MS42 和MS82 雖然對氨和硫化氫的產(chǎn)生有明顯抑制作用但效果不穩(wěn)定，如菌株MS42 和MS82 在雞糞發(fā)酵過程中抑制氨和硫化氫釋放量均呈現(xiàn)出了先下降后升高的趨勢，而菌株MS11 在雞糞發(fā)酵過程中抑制氨和硫化氫釋放量總體是呈下降趨勢，但存在較大波動。結(jié)果表明,菌株MS03 和MS07 對氨和硫化氫的釋放均有顯著的抑制效果。

表1 菌株除臭結(jié)果Table 1 Deodorization result of strains

2.4 拮抗試驗

選取初篩表現(xiàn)較好的菌株MS03、MS07、MS11、MS42 和MS82 進(jìn)行拮抗實驗，結(jié)果表明菌株MS82 與菌株 MS42、MS07 之間有拮抗作用，MS11 與 MS42、MS07相互拮抗，其余菌株間互不拮抗（表2）。

圖1 除臭效果測定Figure 1 Deodorization effect

表2 菌株間的拮抗試驗Table 2 Antagonistic experiment of strains

2.5 復(fù)合菌系構(gòu)建及除臭能力檢測

因為不同菌株對兩種惡臭氣體有不同的除臭效果，據(jù)此將相互不拮抗的菌株兩兩組合，構(gòu)建出5組復(fù)合菌系，分別為：C1（MS03+MS42）、C2（MS03+MS07）、C3（MS03+MS11）、C4（MS03+MS82）、C5（MS11+MS82）。由圖2可以看出，5個復(fù)合菌系均表現(xiàn)出一定的除臭能力，但不同組合之間，除臭能力存在較大差異，其中C2 和C4 組去除兩種惡臭氣體的能力顯著高于其他組，去除率均高于60%，綜合除臭效果極顯著高于其他組合（P＜0.01）。但值得注意的是，復(fù)合菌系如C1 和C3 組雖然也表現(xiàn)出一定的除臭能力，但除臭率與相應(yīng)單菌株相比并無明顯差異，除臭效果并無明顯變化，甚至C3組除臭率顯著低于其單一菌株。

2.6 纖維素降解結(jié)果

剛果紅平板篩選結(jié)果表明，除菌株M42 外，其余4 株菌均能在剛果紅培養(yǎng)基上形成水解圈，同時也具有產(chǎn)生羧甲基纖維素酶的能力，而水解圈大小與其所產(chǎn)生的CMCase活力之間并無明顯的相關(guān)性（表3）。

2.7 除臭菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

對除臭效果較好的5 株菌進(jìn)行16S rRNA 測序。將測序結(jié)果通過Blast 軟件與Genbank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)Blast軟件的結(jié)果，用MEGA6.0軟件通過鄰近法構(gòu)建目標(biāo)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。鑒定結(jié)果如下：MS03為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），MS07為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），MS11 為耐寒短桿菌（Brevibacterium frigoritolerans），MS42為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），MS82 為變異棒桿菌（Coryne?bacterium variabile）。

表3 纖維素降解結(jié)果Table 3 The result of cellulose degradation

3 討論

畜禽排泄物和堆肥中營養(yǎng)豐富且存在大量的微生物，雖然大部分微生物都具有產(chǎn)生惡臭氣體的能力，但惡臭的環(huán)境中可能孕育出可以除去惡臭氣體的微生物，因此可以將此類微生物分離出來作為篩選除臭菌的潛在菌種。本研究從不同處理時期的雞糞堆肥中分離獲得200株菌，通過產(chǎn)氣初篩獲得15株具有除臭潛力的菌株，進(jìn)一步檢測這些菌株的除氨率和除硫化氫率后，發(fā)現(xiàn)有14 株具有除臭效果，除臭菌獲得率為7%。相較于顧文杰[13]、簡保權(quán)等[20]、高華等[21]、魏良[22]所采用的硼酸吸收法和鋅銨絡(luò)鹽比色法篩選除臭菌，本試驗采用濕潤的紅色石蕊試紙和醋酸鉛試紙法對菌株進(jìn)行產(chǎn)氣初篩，方法簡單、便捷，能大幅減少初篩時耗費的時間和精力，提高了定量檢測時獲得除臭菌的機(jī)會。然而，由于大部分微生物在生長過程中或多或少會有一定量氨或硫化氫氣體產(chǎn)生，因此本研究所采用的試紙初篩方法在篩選過程中會淘汰一些具有除臭能力的微生物，導(dǎo)致篩選所獲得的除臭菌數(shù)量較少。通過復(fù)篩獲得5 株具有較好除臭效果的菌株，對菌株16S rRNA 序列分析，確定這5 株除臭菌分屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、貝萊斯芽孢桿菌（Ba?cillus velezensis）、耐寒短桿菌（Brevibacterium frigoritol?erans）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、變異棒桿菌（Corynebacterium variabile）。已有研究表明芽孢桿菌屬在惡臭氣體處理中具有重要作用，如芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的生物同化作用，能有效降低糞便中產(chǎn)生的氨、吲哚等有害氣體濃度，減輕糞便臭味[23]。楊柳等[24]從豬糞堆肥以及土壤中分離獲得了5 株分屬于芽孢桿菌屬和短桿菌屬（Brevibacteriumsp.）的高效除臭菌株。此外，本研究結(jié)果表明除菌株MS42 外，其余4 株菌還有很強(qiáng)的纖維素降解能力。楊偉平等[25]從鵝糞便中篩選出具有纖維素分解能力的芽孢桿菌屬，其可用作動物微生態(tài)添加劑和除臭劑。黃旺洲[26]將高效纖維素分解菌用于豬糞和牛糞的堆肥發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)糞便中的粗纖維和有機(jī)質(zhì)被有力地分解和降解，從而抑制了糞便中的氨和硫化氫氣體的釋放。徐杰等[27]從土壤、秸稈、牛糞等樣品中分離得到3 株具有木質(zhì)纖維素降解能力的細(xì)菌，其具有使堆肥快速升溫和有效除臭的潛力，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬。由此可見，芽孢桿菌屬和短桿菌屬不僅可以通過生物同化作用有效減輕糞便臭味，同時還可以通過對雞糞中纖維素的降解，提高易利用營養(yǎng)物質(zhì)的C/N 進(jìn)而減少氨的釋放，在畜禽糞便除臭方面具有良好的應(yīng)用前景。

圖2 單菌與復(fù)合菌系除臭率Figure 2 Deodorization rate of single bacteria and complex microbial system

圖3 除臭菌16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of 16S rRNA of deodorizing strains

研究表明除臭是多種微生物共同作用的結(jié)果，復(fù)合菌系的除臭效果要優(yōu)于單一菌株。顧文杰[13]的研究表明，在相同的培養(yǎng)時間下，復(fù)合菌系除臭效果要優(yōu)于單株菌的效果。廖瀚峰等[28]將兩種能降解纖維素的除臭菌混合培養(yǎng)后，除臭效果好于單株菌。趙晨曦等[2]也同樣是將篩選出的單株除臭菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，然后應(yīng)用于雞糞發(fā)酵處理，取得了滿意的雞糞無害化處理除臭效果。本研究選取互不拮抗的除臭菌株兩兩組合，構(gòu)建5組復(fù)合菌系，進(jìn)行除臭檢測，C2和C4 組對兩種惡臭氣體的去除率均高于60%，其中對硫化氫的去除率均高于70%，綜合除臭效果顯著高于其他組合，也顯著高于歐亞鈴[8]、魏良[22]篩選的雞糞除臭菌的除臭效果。這是由于雞糞成分復(fù)雜，其本身就有許多微生物，微生物間相互關(guān)系也較為復(fù)雜，改變一種微生物的數(shù)量都可能引起微生物群落的改變，而將除臭菌組合后添加入雞糞可能更易對雞糞中的微生物菌群結(jié)構(gòu)造成影響，有利于除臭菌成為優(yōu)勢菌群并發(fā)揮相應(yīng)功能，從而達(dá)到提升除臭率的目的。同時，雞糞中的惡臭氣體屬于多種臭氣的混合物，單一微生物很難將臭氣全部除去。因此，將具有除臭效果的優(yōu)良菌株構(gòu)建復(fù)合菌系處理雞糞，對減少惡臭氣體的排放，減少氮素?fù)p失，提升堆肥的質(zhì)量具有廣闊的應(yīng)用前景。但值得注意的是，并不是所有復(fù)合菌系的除臭效果都高于單菌株，如組合C1和C3雖然表現(xiàn)出一定的除臭能力，但除臭率與相應(yīng)單菌株相比并無明顯差異，甚至C3組的除臭率顯著低于其單一菌株，雖然構(gòu)建這兩個復(fù)合菌系的各菌株其除臭效果并不差，為什么會出現(xiàn)復(fù)合菌系除臭效果還低于單一菌株的現(xiàn)象呢？究其原因很有可能是組合菌株之間存在生存空間、營養(yǎng)物質(zhì)等因素的競爭，導(dǎo)致各菌株均不能達(dá)到最佳生長狀態(tài)，從而無法達(dá)到很好的協(xié)同效果，影響了各菌株的除臭能力。因此，在構(gòu)建復(fù)合菌株體系的過程中，我們不僅要考慮單菌株的除臭能力，還要著重考慮復(fù)合后各菌株間除了具有拮抗作用外還可能存在的其他競爭因素。

4 結(jié)論

（1）從以雞糞為原料的堆肥中分離出5 株具有除臭功能的菌株，對其進(jìn)行分子鑒定，菌株MS03為芽孢桿菌屬（Bacillussp.），菌株MS07 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），菌株MS11 為耐寒短桿菌（Brevi?bacterium frigoritolerans），菌株 MS42 為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），菌株 MS82 為變異棒桿菌（Corynebacterium variabile）。

（2）5 株具有除臭功能的菌株對惡臭物質(zhì)成分氨和硫化氫氣體均有一定的去除能力，菌株MS03 和MS07對氨和硫化氫的釋放具有顯著的抑制效果。

（3）通過拮抗實驗，構(gòu)建的5 個復(fù)合菌系均表現(xiàn)出一定的除臭能力，C2 組合和C4 組合去除氨和硫化氫氣體的能力高于其他組合，在無害化處理雞糞方面具有較大的潛力和應(yīng)用前景。