楊德全，鞠厚斌，管踦一，葛菲菲，李鑫，沈海瀟，趙洪進，王建，周錦萍

1. 上海市動物疫病預防控制中心， 上海 201103； 2. 上海動物保健有限公司， 上海 201103

貓冠狀病毒(feline coronavirus, FCoV)屬于套式病毒目冠狀病毒科正冠狀病毒亞科甲型冠狀病毒屬甲型冠狀病毒1型[1]，其基因組由1條長約 29 000 個核苷酸(nucleotide, nt)的單股正鏈RNA組成。基因組編碼11個開放閱讀框(open reading frames, ORFs)，包括2個復制酶蛋白(pp1a和pp1ab)、4個結(jié)構(gòu)蛋白[刺突蛋白(spike protein, S蛋白)、核衣殼蛋白(nucleocapsid, N蛋白)、膜蛋白(membrane protein, M蛋白)和包膜蛋白(envelope protein, E蛋白)]和5個附屬蛋白(ORF3a-c和ORF7a, b)[2]。

按照病毒抗原性差異，F(xiàn)CoV 可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種血清型；根據(jù)病毒的致病性，F(xiàn)CoV可分為貓腸道冠狀病毒(feline enteric coronavirus, FECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)兩種生物型，兩種血清型病毒在兩種生物型病毒中普遍存在[3]。FECV致病性低，可引起輕度腸炎或無明顯感染；FIPV毒力強，致死性強。FIPV被認為是FECV的突變體[4]。

目前，負責FCoV生物型轉(zhuǎn)換的分子機制尚未完全研究清楚，主要集中在對ORF3c、ORF7b和S基因的研究。ORF3c和ORF7b基因突變被認為在致病性FIPV生物型的發(fā)生中起作用[5]。ORF3c和S基因突變與貓傳染性腹膜炎(feline infectious peritonitis, FIP)的發(fā)生有關(guān)[6, 7]。本研究收集了3只經(jīng)臨床初步診斷患FIP的貓腹水樣品進行FIPVORF3、ORF7和S基因檢測及遺傳進化性分析，旨在從分子水平尋找其致病的關(guān)鍵靶點，并為FIPV的分子流行病學調(diào)查提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 樣品

腹水樣品取自上海市某寵物醫(yī)院于2018年7月～2018年9月接診的有腹水癥狀的貓，且患貓經(jīng)血常規(guī)、血液生化、X 線檢查初步診斷為FIP，所有腹水樣品均經(jīng)寵物主同意后采集并進行編號。經(jīng)本實驗室建立的實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法檢測，編號為SH1802、SH1807和SH1809的3例樣品均為FIPV陽性。將樣品置于 -80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)、DNA 純化回收試劑盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit、DL-2 000 Marker和E.coliDH5α Competent Cells均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 3株FIPV的RNA提取

參照病毒RNA提取試劑盒說明書，從貓腹水樣品中提取病毒RNA。

1.4 3株FIPV的非結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF3、ORF7和S2序列的擴增

參照文獻合成FIPV非結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF3、ORF7和S2的PCR引物[7]，以3例貓腹水樣品中獲得的病毒RNA為模板，分別利用一步法試劑PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)進行RT-PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性擴增產(chǎn)物電泳后，按照DNA純化回收試劑盒說明書對目的條帶進行膠回收純化，將回收純化產(chǎn)物與pGM-T載體連接，陽性質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有限公司測序。

1.5 3株FIPV的非結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF3、ORF7和S2基因序列分析及進化樹構(gòu)建

應用DNAStar 7.0軟件的MegAlign程序?qū)y序獲得的序列進行同源性比對。從NCBI GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下載FCoV參考毒株(表1)的基因序列，使用MEGA 5.05 軟件中鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建遺傳進化樹， 并用Bootstrap方法重復1 000 次進行檢驗，其他參數(shù)使用默認值。

表1 本研究所用序列比較和分析的FCoV參考毒株

2 結(jié)果

2.1 FIPV部分基因的測序結(jié)果

利用PCR對編號為SH1802、SH1807和SH1809的3個陽性樣品的FIPV非結(jié)構(gòu)蛋白基因ORF3、ORF7和S2進行擴增，將所擴增出的特異性目的片段進行了克隆和測序，將所測序列提交至GenBank，獲得的序列登錄號為MT112929～MT112937。

2.2 3株FIPV的ORF3基因序列分析

從SH1802、SH1807和SH1809 3個樣品中擴增得到FIPV的ORF3a基因總長度為213個核苷酸，均編碼70個氨基酸(amino acid, aa)，與血清Ⅰ型毒株編碼的氨基酸長度一致。它們之間的核苷酸同源性為92.5%～96.2%，氨基酸同源性為 91.5%～95.8%。SH1802、SH1807和SH1809與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性分別為94.8%、93.9%和93.0%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性分別為71.4%、70.4%和71.4%。

從SH1802、SH1807和SH1809 3個樣品中測得的病毒ORF3b基因的核苷酸存在突變，但不引起編碼氨基酸數(shù)量(73個氨基酸)的改變，均與血清Ⅰ型毒株(除Black和FCoV C1Je外)編碼的氨基酸長度一致。兩者之間核苷酸同源性為90.1%～93.7%，氨基酸同源性為89.0%～91.8%。SH1802、SH1807和SH1809與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性分別為91.9%、91.0%和88.3%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性分別為69.0%、67.6%和67.1%。SH1802、SH1807和SH1809與Black和FCoV C1Je之間核苷酸同源性為 82.0%～92.5%，氨基酸同源性為 77.0%～88.7%。

從SH1802、SH1807和SH1809 3個樣品中測得的病毒ORF3c基因與大多數(shù)血清Ⅰ型非截短ORF3c基因一樣，由714個核苷酸組成，編碼237個氨基酸。它們之間核苷酸同源性為95.0%～96.1%，氨基酸同源性為92.4%～95.0%。SH1802、SH1807和SH1809與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性分別為95.9%、94.8%和95.5%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1 146 的核苷酸同源性分別為87.8%、86.9%和87.2%。

根據(jù)獲得的ORF3c基因序列和GenBank 中FIPVORF3c基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，其中SH1802、SH1807和SH1809處于同一遺傳進化分支，并與血清Ⅰ型國內(nèi)外毒株均處于同一大的遺傳進化分支；與血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i處于不同分支，親緣關(guān)系較遠。

2.3 3株FIPV的ORF7基因序列分析

從SH1802、SH1807和SH1809 3個樣品中擴增得到的FIPV的ORF7a基因總長度為306個核苷酸，均編碼101個氨基酸，與血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株編碼的氨基酸長度一致。它們之間核苷酸同源性為93.1%～95.4%，氨基酸同源性為94.1%～97.1%。SH1802、SH1807和SH1809與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性分別為93.1%、94.4%和94.1%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性分別為93.8%、95.1%和93.1%。分析3株FIPV的附屬蛋白ORF7a的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，第9位均為亮氨酸(Leu, L)，第12位均為纈氨酸(Val, V)，第47位則分別為異亮氨酸(Ile, I)、絲氨酸(Ser, S)和天冬酰胺(Asn, N)，見圖2。

圖1 基于 FIPV ORF 3c基因序列的遺傳進化樹

Notes: Amino acids at positions 9, 12 and 47 of ORF7a are highlighted by black boxes.

從SH1807和SH1809 2個樣品中擴增得到的FIPV的ORF7b基因編碼1個由206個氨基酸組成的蛋白質(zhì)ORF7b，與血清Ⅰ型(Black除外)和Ⅱ型毒株編碼的氨基酸長度一致。而樣品SH1802和參考毒株FCoV/NTU2/R/2003均在ORF7b基因的第26～28位有3個連續(xù)核苷酸缺失，導致缺少1個氨基酸。與參考序列相比，它們有多個位點發(fā)生氨基酸的變化，但在第170位的氨基酸均為H。它們之間核苷酸同源性為91.1%～93.2%，氨基酸同源性為90.8%～92.2%。樣品SH1802、SH1807和SH1809與Ⅰ型毒株UG-FH8的核苷酸同源性分別為90.9%、91.8%和92.9%，與Ⅱ型毒株FIPV 79-1146的核苷酸同源性分別為89.5%、91.3%和91.0%。

根據(jù)獲得的FIPVORF7b基因序列和GenBank中FIPVORF7b基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，其中SH1802、SH1807和SH1809處于同一遺傳進化分支，并與UU30、UU54和C3663親緣關(guān)系最近，與其他血清Ⅰ型毒株(RM除外)均處于同一大的遺傳進化分支；與血清Ⅰ型RM、血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i處于不同分支，親緣關(guān)系較遠。

2.4 3株FIPV的S2基因的序列分析

從SH1802、SH1807和SH1809 3個樣品中擴增得到的S2基因序列之間核苷酸同源性為 88.9%～90.1%，氨基酸同源性為92.4%～94.4%。它們與參考株S2基因序列的核苷酸相似性為64.6%～89.51%，氨基酸相似性為61.3%～95.6%。SH1802、SH1807和SH1809的S1/S2裂解位點處有連續(xù)的R-R-S/A-R-R-S序列模體(圖4A)，符合FIPV裂解位點的氨基酸序列特征[8]。3個樣品的S2蛋白在第 1 045 位存在甲硫氨酸(Met, M)被亮氨酸完全替換，即M1045L，第 1 047 位則沒有發(fā)生變化，均為S；而SH1802、SH1807在 1 108 位也存在天冬氨酸(Asp, D)被谷氨酸(Glu, E)完全替換，即D1108E，而SH1809在該位置未發(fā)生替換(圖4B)。

圖3 基于FIPV ORF7b基因序列的遺傳進化樹

A: Amino acids sequences analysis of spike S1/S2 site. B: Amino acids sequences alignments of the spike protein 2.

Fig.4 Amino acids sequences analysis of spike protein

根據(jù)獲得的S2基因序列和GenBank 中FIPVS基因的參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，其中SH1802、SH1807和SH1809處于同一遺傳進化分支，并與HLJ/DQ/2016/01和UG-FH8親緣關(guān)系最近，與其他血清Ⅰ型毒株均處于同一大的遺傳進化分支；與血清Ⅱ型FIPV 79-1146、DF-2和DF-2 R3i處于不同分支，親緣關(guān)系較遠。

圖5 基于FIPV S2基因序列的遺傳進化樹

3 討論

以往研究表明，所有FECV中的ORF3c基因均是完整的，完整的ORF3c基因被認為是FECV 在腸道中有效復制所必需的，但對FIPV的復制則是非必需的[9]。在FIPV中，只有71.4%的ORF3c基因發(fā)生了突變，意味著ORF3c基因的突變并不是導致FIP的唯一原因[10]。本研究中的SH1802、SH1807和SH1809 3個樣品均為患FIP貓的腹水樣品，且病毒的ORF3c基因均為完整的3c基因，與以往研究結(jié)果一致。

ORF7b基因的缺失不僅存在于FECV中，而且也存在于FIPV中。然而，在大多數(shù)野毒株中沒有發(fā)現(xiàn)ORF7b基因的缺失，意味著該基因的缺失與致病性無關(guān)[11]。本研究中3例患FIP貓的腹水樣品里，有2例檢測到具有完整的FIPVORF7b基因，而1例存在3個核苷酸的缺失，這表明ORF7b基因的缺失與致病性無關(guān)。2例樣品可以同時檢測到具有完整ORF3c基因和完整ORF7b基因，而另1例檢測到完整ORF3c基因和缺失3個核苷酸的ORF7b基因，推測ORF3c和ORF7b基因不是決定FCoV毒力的唯一因素，與之前報道的一致[5]。

據(jù)報道，在118個I型FIPV中，95.8%的FIPV顯示S基因中有M1058L或S1060A[以C1Je (DQ848678)為參考毒株]，即M1045L或S1047A[以Black (EU186072)為參考毒株]的突變，而183個FECV樣品中沒有發(fā)生突變。這兩個氨基酸位點的差異，可用于鑒別診斷FIPV和FECV兩個生物型[12]。本研究中3株病毒的S蛋白第1 045位存在氨基酸的完全替換，即M1045L，第1 047位則沒有發(fā)生變化，均為S。有研究認為，ORF3c和S基因的突變與FIP的發(fā)生有關(guān)[6, 7]。腹水標本中80%的FCoVs在S和3c基因中均有突變，余下的20%在S或3c基因中有突變，研究顯示這兩個基因中的一個或兩個突變可能參與了FCoV組織嗜性的改變[6]。另有研究報道[13,14]，S蛋白的突變與FIP的發(fā)生機制有關(guān)。本研究中3株病毒的3c基因均是完整的，而S基因均在 1 045 位發(fā)生Met被Leu替換，因此推測S基因的突變可能參與了FCoV組織嗜性的改變。

本研究中的3株病毒在ORF7b基因的第170位氨基酸均為組氨酸(His, H)，這與大部分FIPV在第170位氨基酸為H，而FECV在此位置為酪氨酸(Tyr, Y)的報道相一致[7]。有研究證明，與FECV的S1/S2位點模體序列R-R-S/A-R-R-S相比，F(xiàn)IPV在該區(qū)域表現(xiàn)出高度的變異性[8]。本研究的3株病毒的S1/S2裂解位點符合FIPV裂解位點的氨基酸序列特征。S1/S2位點的突變與病毒致病特性的改變有關(guān)，是FIP發(fā)生的關(guān)鍵因素[8]。

遺傳進化分析結(jié)果表明，基于ORF3c、ORF7b和S2基因的進化樹可以分成兩個主要分支，即以Black為代表的血清型Ⅰ型毒株進化分支和以FIPV 79-1146為代表的血清型Ⅱ型毒株進化分支。目前，世界上主要流行的FIPV主要屬于血清型Ⅰ型毒株[15]。值得注意的是，本研究中的3株病毒與血清型Ⅰ型毒株的親緣關(guān)系最近，進一步證明這3株病毒屬于血清型Ⅰ型毒株。目前國內(nèi)對FIPV的分子流行病學研究較少，本研究結(jié)果提示，需要加強監(jiān)測FIPV分子變異動態(tài)，加強對FIPV的風險評估，這將對FIP的預防和控制具有重要意義。