丘家杵，阮 萍，雍軍光，馮博華，黃代政，沈洪濤

1. 廣東藥科大學(xué)勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，廣東 廣州 510310 2. 廣東藥科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，廣東 廣州 510006 3. 廣東藥科大學(xué)附屬門診部，廣東 廣州 510235 4. 廣東省醫(yī)藥3D打印機及個性化醫(yī)療工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006 5. 廣西醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系，廣西 南寧 530021 6. 廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541001

引 言

人血紅蛋白是由2個α和2個β亞基組成的四聚體，最重要的功能是運輸氧到人體組織器官供細胞代謝，維持其正常功能。此外還能調(diào)節(jié)紅細胞代謝，參與電子傳遞等過程[1]。迄今為止，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了超過1000種與血紅蛋白合成或結(jié)構(gòu)異常相關(guān)的疾病[2]，缺乏有效臨床手段治愈此類疾病，提示現(xiàn)有的知識仍無法滿足相關(guān)疾病的診療需求[3]，這就需要進一步研究Hb的特性、結(jié)構(gòu)與功能。

以往物質(zhì)分析技術(shù)大多會在測試過程中損壞被測樣本，光譜學(xué)方法有不破壞測試樣本的優(yōu)勢。紫外可見吸收光譜(ultraviolet visible absorption spectra)和傅里葉紅外變換光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)可以不破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提下對物質(zhì)結(jié)構(gòu)、組成和含量等進行分析。紫外可見吸收光譜可以用于分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和研究蛋白質(zhì)間相互作用等[4]。FTIR則還有掃描快、高分辨率和高靈敏度等特點。近年來，F(xiàn)TIR廣泛的應(yīng)用于各行業(yè)包括食品、農(nóng)業(yè)、藥物和煉油與化工等的研究中； 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用也越來越受關(guān)注，應(yīng)用范圍也越來越廣，如利用FTIR研究證明乳腺疾病的病理學(xué)等級與微鈣化存在關(guān)聯(lián)，提出可基于FTIR建立更有效的疾病診斷方法[5]； 利用FTIR可實時監(jiān)測藥物作用時乳腺癌細胞的病理生理學(xué)改變，基此實時評價藥物療效，從微觀層面了解病理生理學(xué)改變和藥物作用對治療有重大意義。FTIR技術(shù)的高精確度、靈敏度和良好的可重復(fù)性，可以準確的對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進行分析[6]。

有關(guān)Hb光譜研究的常見的報道是探究外界條件或疾病對Hb光譜的影響，如環(huán)境條件發(fā)生改變或受到電離輻射或長期處于某些慢性疾病狀態(tài)時，人的Hb光譜就會發(fā)生相應(yīng)的改變，提示Hb結(jié)構(gòu)功能的改變[7-9]。而高純度且覆蓋年齡段較廣的健康人紅細胞中Hb光譜的研究幾乎沒有報道，因此本研究將通過紫外可見吸收光譜和FTIR光譜技術(shù)探究健康人Hb的光譜學(xué)特征，初步建立健康人Hb的參照光譜，為以后利用光譜學(xué)研究疾病或環(huán)境與Hb結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供參考對照圖譜。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Tensor37傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker，德國)，U-3010紫外光譜儀(日立，日本)，JY600C電泳儀(君意，北京)，臺式冷凍高速離心機(Hettich Mikro，德國)，8000-14000透析袋(索萊寶，北京)。

1.2 研究對象與采樣

1.2.1 樣本

隨機選取經(jīng)醫(yī)院體檢為健康的21～80歲成人共232名，均為漢族； 機體隨著年齡增長而逐漸老化，血液成分亦會發(fā)生相應(yīng)改變[10-11]，故將年齡劃分為4組，分別是a組21～35歲63人(男31人，女32人)，b組36～50歲60人(男31人，女29人)，c組51～65歲58人(男30人，女28人)，d組66～80歲51人(男25人，女26人)。

1.2.2 樣本采集與Hb樣品制備

研究對象至少禁食8 h，抽取肘部外周靜脈血于EDTA-K2抗凝管。于12 h內(nèi)將2 mL全血樣品用生理鹽水洗滌后3 000 r·min-1離心10 min，除上層血漿及中間絨毛層細胞，重復(fù)3次。加蒸餾水于4 ℃冰箱破裂12 h，4 ℃ 12 000 r·min-1離心45 min，取上層Hb溶液用G-75葡聚糖凝膠層析法純化Hb，濃縮后聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定Hb純度達95%以上。部分純化Hb溶液樣品用于紫外光譜測試，另一部分冷凍干燥后用于FTIR光譜測試。

1.3 測試分析與數(shù)據(jù)處理

以2 mL去離子水稀釋100 μl待測Hb溶液樣品，紫外光譜掃描波長范圍設(shè)定為190～800 nm，精度±0.1 nm，測試前進行空白掃描與背景扣除，每個樣本重復(fù)測量3次，取其均值圖譜。

Hb粉末與KBr粉末比例混合制成錠片，紅外光譜儀采用空氣冷卻DTGS檢測器，掃描的范圍為4 000～400 cm-1，重復(fù)掃描64次，分辨率設(shè)置為4 cm-1，室溫25 ℃，濕度控制在25%以下。掃描前以純KBr窗片作空白背景，進行水汽與CO2自動校正，重復(fù)3次，取均值圖譜。

紫外可見吸收光譜采用origin9.0軟件進行分析； 健康人Hb紅外光譜數(shù)據(jù)使用OPUS 7.0軟件采用11點最小二乘法平滑函數(shù)法進行處理，為消除壓片濃度差影響將光譜縱坐標歸一化。利用OMNIC 8.0軟件的QC比較功能分析光譜間的相似度，對紅外光譜特征吸收帶Amide Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)進行二階導(dǎo)數(shù)和傅里葉去卷積處理，根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)譜和去卷積譜所得信息結(jié)合Peak Fit 4.0軟件對Amide Ⅰ帶進行Gaussian曲線擬合處理，獲得Hb Amide Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)組成。使用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 Hb紫外吸收光譜及其吸收峰指認

測得的4組Hb紫外光譜如圖1中a，b，c，d所示，4組Hb紫外光譜的譜形相同，吸收峰位重置相同。4組Hb平均紫外光譜在190～800 nm的范圍主要有5個吸收峰，峰位均位于274，346，414，540和576 nm處，如圖2所示。其中274 nm處的吸收峰由Hb的酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸殘基的共軛發(fā)色團吸收紫外光而產(chǎn)生，體外研究表明Hb在處于異常狀態(tài)時會導(dǎo)致增色或減色效應(yīng)，可能導(dǎo)致三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致原本包裹的芳香族氨基酸殘基暴露于溶液中[4, 12]； 414 nm處的吸收峰是血紅素卟啉環(huán)的特征吸收峰，540和576 nm處的吸收峰分別屬于氧合血紅蛋白(HbO2)的α和β吸收峰，反映的是Hb的攜氧能力[4, 12]。各年齡組Hb紫外光譜5個吸收峰處的平均吸光度值見表1，各年齡組相對應(yīng)特征峰位的吸光度值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，結(jié)合圖1說明隨著年齡增長Hb紫外光譜不會發(fā)生改變。

圖1 4組血紅蛋白紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Visble absorption spectra of Hb

圖2 血紅蛋白紫外可見吸收光譜Fig.2 Representative UV-Visble absorptionspectra of Hb sample

表1 4組血紅蛋白紫外可見吸收光譜吸收峰均值±標準差Table 1 Mean values and standard deviations of UV-Visble absorption spectra of Hb

2.2 Hb FTIR光譜及其吸收峰指認

4組Hb FTIR平均光譜如圖3所示，經(jīng)過基線校正、縱坐標歸一化等消除實驗誤差，獲得Hb FTIR全信息光譜。a，b，c，d分別代表的4組Hb平均光譜顯示各組間相應(yīng)吸收峰均有相同位置，峰形相同。通過QC比較統(tǒng)計學(xué)功能可以分析光譜間的差異，當光譜間相似度為100時，說明光譜是完全一樣的，但即使是同一物質(zhì)，不同制樣批次所測得的光譜也會由于實驗誤差和儀器的精確度導(dǎo)致的細微差異[7]。根據(jù)Hb全信息紅外光譜相似度比較可以反映不同健康人的Hb樣本的FTIR光譜是否相同。同年齡組組內(nèi)Hb樣品間的FTIR光譜相似度結(jié)果和組間平均光譜相似度結(jié)果見表2，年齡組內(nèi)和組間的Hb光譜相似度都達到了95%以上，光譜間的細微差異可能是由于制樣及壓片等誤差造成的，初步說明同一年齡組的健康成人Hb FTIR光譜可能是相同的。

圖3 4組血紅蛋白FTIR光譜Fig.3 FTIR spectra of Hb

表2 血紅蛋白FTIR光譜相似度Table 2 The spectral similarity of Hb

通過上述檢測分析，獲得的健康人Hb FTIR光譜如圖4所示，在研究病例時，可作為健康對照光譜進行比較分析。健康人Hb FTIR光譜主要由Amide Ⅰ區(qū)、Amide Ⅱ區(qū)、Amide Ⅲ區(qū)、Amide Ⅳ區(qū)、Amide Ⅴ區(qū)、Amide Ⅵ區(qū)、Amide Ⅶ區(qū)、Amide A區(qū)、Amide B區(qū)九個Amide模型吸收帶組成。在4 000～400 cm-1的中紅外光譜范圍內(nèi)均主要有13個特征吸收譜帶，吸收譜帶的位置及其歸屬見表3。

圖4 血紅蛋白FTIR光譜Fig.4 Representative FTIR spectra of Hb

表3 血紅蛋白FTIR光譜吸收帶歸屬Table 3 General band assignment of FTIR spectra of 4 groups Hb

2.3 Hb FTIR光譜Amide Ⅰ帶分析

2.3.1 Hb FTIR光譜Amide Ⅰ帶分析及其子峰指認

4組Hb的平均FTIR光譜Amide Ⅰ帶的二階導(dǎo)數(shù)光譜如圖5所示，Hb的Amide Ⅰ帶作為特征吸收帶，其對Hb的二級結(jié)構(gòu)變化十分敏感，可靈敏反映Hb的二級結(jié)構(gòu)改變和樣品光譜間差異。Amide Ⅰ帶在FTIR光譜中常為相互重疊形成的寬峰，常對紅外光譜數(shù)據(jù)進行二階導(dǎo)數(shù)處理以分辨Amide Ⅰ帶中被重疊掩蓋的子峰，獲得更全面的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息。4個年齡組組內(nèi)各樣品光譜間和組間光譜Amide Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)相似度結(jié)果見表4，組內(nèi)光譜間和組間光譜QC比較分析得相似度均高于99%，其中的微小差異是由于誤差而產(chǎn)生的，說明4組Hb FTIR光譜的二階導(dǎo)數(shù)譜是相同的。

圖5 4組血紅蛋白酰胺Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)譜Fig.5 Secondary derivative spectra of Amide Ⅰ bands of Hb

表4 血紅蛋白酰胺Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)譜吸收帶均值±標準差和相似度

Table 4 The mean values and standard deviations of wavenumbers of the Amide Ⅰ bands and spectral similarities of thesecondary-derivative of Hb

Group酰胺Ⅰ帶(均值±標準差)酰胺Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)譜相似度/%組內(nèi)比較組間比較a1 611.7±0.2, 1 691.2±0.3>99a vs b=99.9a vs c=99.5a vs d=99.6b1 611.6±0.4, 1 691.2±0.04>99b vs c=99.7b vs d=99.8c1 611.6±0.2, 1 691.3±0.5>99c vs d=99.9d1 611.5±0.3, 1 691.3±0.8>99d vs a=99.6

健康人Hb二階導(dǎo)數(shù)譜及其傅里葉去卷積譜如圖6所示，其中二階導(dǎo)數(shù)譜為負峰，傅里葉去卷積譜為正峰，傅里葉去卷積譜的峰位與二階導(dǎo)數(shù)譜譜峰一致，Hb二階導(dǎo)數(shù)譜和傅里葉去卷積譜均有11個子峰，子峰譜帶歸屬結(jié)果見表5[7, 13]。

2.3.2 Hb FTIR光譜Amide Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)含量分析

FTIR還可以用于定量分析物質(zhì)的結(jié)構(gòu)含量，可以進一步的了解物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。利用peakfit 4.0軟件通過曲線擬合的方式直觀的展示Amide I帶的子峰譜，峰位，峰面積等，同時可定量分析健康人Hb Amide Ⅰ帶的二級結(jié)構(gòu)組成。Hb平均紅外光譜Amide Ⅰ區(qū)的曲線擬合的圖譜見圖7，從上至下依次是典型原始譜、擬合計算譜、擬合各子譜，結(jié)合Amide I帶的二階導(dǎo)數(shù)和去卷積光譜分析得到的子峰歸屬結(jié)果，對Hb二級結(jié)構(gòu)進行曲線擬合定量計算，得到的Hb Amide Ⅰ帶各二級結(jié)構(gòu)含量計算結(jié)果見表6，健康人Hb的二級結(jié)構(gòu)含量高低順序依次為α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲，說明健康人Hb的Amide Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)是以α-螺旋為主的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

圖6 血紅蛋白酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)譜和去卷積譜(a): 二階導(dǎo)數(shù)譜; (b): 去卷積譜Fig.6 Secondary-derivative and deconvolution spectraof Amide Ⅰ bands of Hb(a): Secondary derivative; (b): Deconvolution

表5 血紅蛋白二階導(dǎo)數(shù)譜吸收帶歸屬Table 5 General band assignment of secondary-derivative spectra of Amide Ⅰ bands of Hb

圖7 血紅蛋白Amide Ⅰ帶曲線擬合圖譜Fig.7 Gaussian fitting of Amide Ⅰ band of Hb

表6 血紅蛋白二級結(jié)構(gòu)組分含量Table 6 Percentage of secondary structure of Hb

3 結(jié) 論

檢測得到健康人Hb的紫外可見吸收光譜和FTIR光譜； 通過光譜學(xué)特征分析，獲得了健康人Hb的光譜學(xué)特征及結(jié)構(gòu)信息； 發(fā)現(xiàn)健康人的Hb紫外可見吸收光譜、FTIR光譜不受年齡因素影響。分析測得的Hb紫外可見吸收光譜、FTIR光譜的光譜學(xué)特征，F(xiàn)TIR光譜的特征吸收帶Amide Ⅰ帶的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)健康人Hb Amide Ⅰ帶由11個子峰重疊而形成，其二級結(jié)構(gòu)是以α-螺旋為主的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。為醫(yī)學(xué)病理研究提供了健康人Hb的相關(guān)信息。

致謝：感謝廣東省醫(yī)藥3D打印機及個性化醫(yī)療工程技術(shù)研究中心提供的技術(shù)支持。