艾菊， 張泓欣, 羅威， 高冬麗

(云南師范大學 云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，云南 昆明 650500)

馬鈴薯原產于南美洲的安第斯山區(qū)，是茄科茄屬一年生的雙子葉植物.由于其耐性強、豐產性高、適應性廣且營養(yǎng)成分全，在我國已經成為繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物[1].馬鈴薯塊莖是生長在土壤中的縮短而肥大的變態(tài)莖.塊莖形狀簡稱為薯形，是馬鈴薯的重要農藝性狀.薯形在塊莖形成早期既已確定，不同的薯形是因為在塊莖形成過程中，細胞向各個方向分裂和增大的速度不同所造成的[2-3].現(xiàn)有的栽培品種薯形比較規(guī)則，一般為圓形、橢圓形或長形.各地消費者對薯形的喜好不同，不同加工目的對薯形的要求也不同，因此薯形的選育將滿足消費習慣的需求，加速馬鈴薯加工業(yè)的發(fā)展.

Van Eck等人首次詳細地研究了薯形的遺傳規(guī)律，利用二倍體雜交群體將控制圓形薯形的基因(Ro)定位在10號染色體，且圓形相對于長形是顯性的[4].Prasher等利用二倍體雜交群體定位了2個薯形主效數(shù)量性狀位點(QTL)，分別位于2號和10號染色體上，10號染色體上的QTL效應大于2號染色體上的QTL，此外還有3個微效QTL位于其他染色體上[3].Lindqvist-Kreuze等利用二倍體回交群體將薯形主效QTL定位在10號染色體上，此外在5號和12號染色體上的兩個微效QTL對薯形也有影響[5].綜上所述，薯形是一個相對簡單遺傳的性狀，10號染色體上的Ro基因是控制塊莖形狀的主效位點，也存在其他位點的修飾效應.Endelman等在2016年將Ro基因定位在48.2-51.9 Mb的區(qū)間內[6].

番茄和馬鈴薯同屬于茄科作物.目前已經克隆調控番茄果形的多個基因，包括SUN、OVATE、FAS(Fasciated)、sov1(suppressor of ovate ) 等[6-9].OVATE和sov1均屬于OFP(Ovate Family Protein)家族，其中OVATE編碼SlOFP1，sov1編碼SlOFP20.Wu等人利用薯形分離群體發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中的同源基因StOFP20與薯形緊密連鎖，是Ro位點的編碼基因，因此，OFP20不僅調控番茄果實形狀，同時也是馬鈴薯薯形的調控因子[10].但是，在Wu等的研究中沒有提供StOFP20的編碼序列，StOFP20在參考基因組DM中也是缺失的，且馬鈴薯DM基因組中約含有25個OFP基因，因此通過圖位克隆，明確StOFP20的編碼序列是必要的.研究利用一個薯形分離的群體，克隆了StOFP20，為進一步研究薯形調控機制提供基礎.

1 材料與方法

1.1 DNA提取

將馬鈴薯的種子完全浸泡在2 mg/L的赤霉素溶液中，待24 h后將種子播種至濕度適中的土壤中.約15 d左右，將長出的一定高度的小苗移栽至96孔的穴盤內，待其長至約四片幼葉后進行采樣.采集馬鈴薯的幼葉1-2片，采用CTAB法提取C151群體后代的基因組DNA.

1.2 分子標記驗證

在前期的研究中，已經對C151自交群體進行了Bin分型[11].本研究利用16份Bin基因型不同的植株對InDel標記進行了驗證.聚合酶鏈式反應(PCR)體系為：PCR體系11 μL，其中2×PCR master mix(Promega)5.5 μL，正向引物(10 μM)0.25 μL，反向引物(10 μM)0.25 μL,去離子水 4 μL,DNA 1 μL.PCR擴增程序為：94 ℃,3 Min;35個循環(huán)：94 ℃,30 Sec,55 ℃,30 Sec,72 ℃,15 Sec,循環(huán)結束后72 ℃ 5 Min.擴增片段用丙烯酰胺凝膠電泳鑒定.所用標記的引物序列為：S3aF-TTAGTGTAGGGGTAAAATGG,S3aR-TGCAGACCCTTAAACTTGTC;S4aF-GACTCTCAAAGAGGACGTTG,S4aR-TCCTCCAAGTGACTGAGACT;S5aF-CCCCTCCTTGACTTTTATTT,S5aR-ATACCCTTGGAGAAAATGGT; i-5F-ATTTAGGTGGGTTGAAGTGA, i-5R-ATAATCAACAGCCCATTCCT.

1.3 StOFP20的克隆

以葉片CDNA為模版，從后代分離群體中擴增StOFP20的序列.擴增引物為StOFP20F-A T G G G G A A T T A T A G G T T T A G A T T A T;S t O F P 2 0 R-T T A C T T C A G T C G A A T T T C A G T G A T G.StOFP20與SlOFP20的相似性比對采用NCBI blastp，OVATE結構域預測采用NCBI的Conserved Domain Search Service(CD Search).

2 研究結果

2.1 薯形分離群體的構建

C151是一個自交親和的二倍體材料.利用該材料進行自交，自交后收獲果實，并進行F2代播種(圖1).對F2代植株的薯塊進行調查，發(fā)現(xiàn)薯形出現(xiàn)圓形和橢圓形的分離，且在結薯初期能清楚地用肉眼進行表型鑒定(圖2).

從左到右依次為：親本CIP151的花；自交后的果實；經過清洗后的種子；播種后的幼苗

圖1 自交分離群體的構建

Fig.1 Construction of a segregating population for tuber shape

從左到右依次為：親本CIP151的薯形；后代的圓形薯塊；后代的橢圓形薯塊

圖2 親本CIP151自交后代的薯塊形狀

Fig.2 Tuber shape of the progeny obtained by selfing of the parent C151

2.2 StOFP20的精細定位

該群體的植株均已測序，并進行了Bin分型[11].根據(jù)文獻報道的薯形基因的定位區(qū)間[6]，對該群體的相應區(qū)間48-52 Mb進行了分析，發(fā)現(xiàn)基因型與表型相符合，即基因型為b和h時，薯形為圓，基因型為a時，薯形為橢圓.根據(jù)基因型和表型，將區(qū)間定位在bin61-bin63之間，物理距離為834 kb(表1).在Bin61-Bin63之間設計多態(tài)性引物，并進行驗證，找到4個能區(qū)分a、b和h基因型的InDel標記，分別為S3a、S4a、S5a和i-5，其中i-5的標記驗證如圖3所示.利用這4個標記對Bin61-Bin63之間的重組體進行分型，最終得到3種有效的重組體.C151-0758重組體的交換發(fā)生在S3a和S4a之間，基因型為ah，表型為圓形，說明基因在S3a之后；C151-0809重組體的交換發(fā)生在S5a和i-5之間，基因型為ah，表型為橢圓形，說明基因在i-5之前；C151-0044重組體的交換發(fā)生在S5a和i-5之間，基因型為ha，表型為圓形，說明基因在i-5之前.綜上信息，將薯形基因定位S3a和i-5之間，物理距離為298 kb(圖4).

表1 Ro基因的初步定位

圖3 InDel分子標記i-5的開發(fā)

白色方框代表a基因型，即橢圓形基因型，黑色方框代表h基因型，即圓形基因型，箭頭所指方向為基因所在的方向

圖4Ro基因的精細定位

Fig.4 Fine-mapping of theRogene

2.3 StOFP20的克隆

以SlOFP20的序列比對該區(qū)間的基因，找到了同源基因StOFP20，該基因全長為1 041 bp，不含有內含子.利用薯形分離的植株擴增StOFP20，發(fā)現(xiàn)在基因型為b即圓形塊莖中能夠擴增出來，在基因型為a即橢圓形塊莖中不能擴增出條帶，與StOFP20在長形的DM塊莖中缺失情況一致(圖5).SlOFP20和StOFP20序列均有OVATE結構域，其蛋白相似性達到80%(圖6).

圖5 StOFP20在圓形薯塊(基因型為b)和橢圓形薯塊(基因型為a)中的擴增

方框為OVATE結構域

圖6 StOFP20和SlOFP20的蛋白序列比對

Fig.6 Protein sequence alignment of StOFP20 and SlOFP20

3 討 論

OFP基因數(shù)量眾多，在擬南芥中有18個OFP基因[12]，在水稻和番茄中分別鑒定出31個和23個OFP基因[13].Liu等利用同源基因比對，在馬鈴薯參考基因組DM中鑒定出25個OFP基因，將其命名為StOFP1-StOFP25，其中StOFP20的編碼基因是PGSC0003DMC400010028.DM是長形薯形，基因組中不含有與SlOFP20相似的基因，且PGSC0003DMC400010028在進化樹上也沒有與SlOFP20聚為一類[13].因此，將PGSC0003DMC400010028命名為StOFP20是不恰當?shù)?

Wu等利用長形薯形的DM和圓形薯形的M6雜交群體，將Ro薯形位點定位到M6中包含有StOFP20的區(qū)間[10].由于在DM中StOFP20是缺失的，馬鈴薯公共數(shù)據(jù)庫只提供了M6的基因組序列，Wu等的文章中也沒有提供StOFP20的編碼序列，因此StOFP20的完整編碼序列是未知的.本文利用薯形分離的151自交群體，將Ro位點定位到298 kb內，并利用SlOFP20的序列進行比對，克隆了StOFP20.該基因可以在圓形薯形中擴增出來，但在橢圓形薯形的植株中不能擴增出來，與Wu等的研究結果一致[10].此外，作為標記能否擴增出來在實際操作過程中很難鑒定，如實驗過程中的DNA質量和PCR過程失誤都有可能導致擴增不出來，因此本研究提供的InDel標記能夠清楚地區(qū)分圓形和橢圓形(長形)塊莖，有利于將分子標記應用于薯形的早期選擇.

番茄果實和馬鈴薯塊莖的形成機制是完全不同的，番茄果實是子房受精膨大形成的，塊莖是地下匍匐莖膨大形成的，OFP20可以調控馬鈴薯塊莖和番茄果實的形狀，由此可見OFP20的作用機制是保守的.番茄SlOFP20調節(jié)果實形狀的機制可能是OFP20與TRM(TONNEAU1 Recruiting Motif)蛋白復合體在細胞質和微管的動態(tài)定位調控了細胞分裂，進而影響了番茄果實形狀[10].在馬鈴薯中，OFP20是否與TRM互作共同調控塊莖形狀還需進一步研究.