王海英 孫亞東 金濤 武楊 謝立凱 張兵 李柯旻 馬彥 姜艷靜

(吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 130000)

維生素D的非經(jīng)典途徑研究表明〔1〕，維生素D在葡萄糖刺激胰島素分泌及維持正常血糖水平起到一定作用,血糖升高后，會增加機體的游離脂肪酸和慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)物的增加及機體抗氧化能力的下降。研究表明〔2〕,早期維生素D缺乏可能會促進糖尿病氧化應(yīng)激反應(yīng)。人體的胰腺血管平滑肌、肝、腎、小腸、心肌細胞等全身各組織器官中存在維生素D受體(VDR)，前期實驗已經(jīng)證實，VDR基因 Bsml位點基因多態(tài)性與中國吉林地區(qū)漢族人群2型糖尿病(T2DM)密切相關(guān)，可能是該地區(qū)人群T2DM的一個易感基因〔3〕,目前關(guān)于VDR多態(tài)性與氧化應(yīng)激的相關(guān)性還未完全闡明,本研究旨在探討吉林漢族人群VDR基因多態(tài)性對糖尿病氧化應(yīng)激的影響。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 選擇2017年1月至2017年6月在吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科門診及住院的T2DM患者150例為T2DM組，按1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病標準診斷：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 h PG)≥11.1 mmol/L，除外腎功能損害及長期服用影響骨代謝藥物者；同期收集醫(yī)院體檢中心健康體檢者100例為正常對照組，記錄姓名、性別、年齡、體重、身高、血壓。研究對象均為吉林地區(qū)的漢族人群，無血緣關(guān)系，女性患者排除妊娠，對實驗?zāi)康闹橥狻?/p>

1.2實驗室指標檢測：①受試者禁食8～10 h，晨起抽取空腹肘正中靜脈血，測定FPG、2 h PG、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、糖化血紅蛋白(HbA1c)，生化指標由用奧林巴斯AU5400全自動生化分析儀測定，HBA1c使用高效液相色譜法測定。②在早晨7點排空尿液后開始取尿液到第2天早晨，使用8-羥基脫氧鳥苷酶(OHdG)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測尿液中的8-OHdG，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。收集每位入選者外周靜脈血4 ml,采用酚-氯仿法提取基因組DNA。通過聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)檢測T2DM患者VDR Bsml基因多態(tài)性。引物:正義鏈5'- CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3',反義鏈5'-AACCAGCGGAAGAGGTCAAGGG-3'(上海生工合成)。應(yīng)用PCR試劑盒,PCR體系為25 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 3 min,變性94℃ 30 s,退火62℃ 30 s,延伸72℃ 1 min,30個循環(huán),總延伸72℃ 5 min。繼以限制性內(nèi)切酶37℃水解過夜,置4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察,照相記錄結(jié)果。VDR Bsml 位點3種基因型:BB(800 bp)、Bb(800，650，175 bp)、bb(650，175 bp)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 運用在線軟件檢測是否符合Hardy-weinberg平衡規(guī)律計算基因型和等位基因頻率。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行t及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 兩組年齡、性別比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,T2DM組體重指數(shù)(BMI)、FPG、2 h PG、HbA1c、TC、TG、LDL-C均顯著升高，HDL-C水平顯著降低(P<0.05，P<0.01),見表1。

2.2VDR Bsml位點基因型及等位基因分布 兩組研究對象基因型分布均符合Hardy-weinberg平衡規(guī)律。T2DM中BB基因型出現(xiàn)頻數(shù)為2,所以將BB、Bb基因型合并分析。與正常對照組比較，T2DM組中BB+Bb基因型頻率明顯高于正常對照組(P<0.05)，B等位基因頻率明顯高于正常對照組(P<0.05)，基因型bb明顯低于正常對照組(P<0.05)。見表2。

表1 兩組一般情況的比較

與正常對照組相比:1)P<0.05， 2)P<0.01；表2同

表2 兩組VDR Bsml各基因型和等位基因分布〔n(%)〕

2.3兩組Bsml各基因型與尿8-ObdG水平的比較 T2DM組中，與bb基因型〔(65.9±15.1)ng/mg Cr〕比較,BB+Bb基因型尿8-OHdG水平〔(93.5±32.6)ng/mg Cr〕顯著升高(P<0.01)。正常對照組中，BB+Bb基因型與bb基因型尿8-OHdG水平〔(76.6±20.3)、(63.9±14.6)ng/mg Cr〕無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。兩組BB+Bb基因型8-OHdG水平差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

T2DM的病因研究發(fā)現(xiàn),遺傳和環(huán)境包括飲食因素發(fā)揮了很大作用，維生素缺乏會影響糖代謝，胰島素分泌受損，胰島素抵抗，最終導(dǎo)致糖尿病〔4〕。1,25二羥維生素D都必須通過與VDR結(jié)合才能發(fā)揮其生理效應(yīng)，VDR廣泛存在于全身幾乎所有的有核細胞。胰腺組織中存在VDR，目前已發(fā)現(xiàn)VDR的基因多態(tài)性與糖耐量和胰島素分泌相關(guān)〔5,6〕。

高血糖等多種代謝紊亂會引起炎癥和氧化應(yīng)激增強，增加表達超氧化物歧化酶(SOD)是細胞降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物過度表達的防御機制。但體內(nèi)長期的高血糖、高血脂可以直接導(dǎo)致T2DM患者體內(nèi)慢性氧化應(yīng)激增強，又可損害線粒體能量代謝，進一步產(chǎn)生更多脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致細胞水平氧化與抗氧化過程失衡，形成惡性循環(huán)，引起不可逆的細胞和組織損傷。研究表明活性氧(ROS)可直接損傷線粒體,引起線粒體功能障礙,進而損傷胰島β細胞，影響葡萄糖刺激的胰島素分泌，引起胰島素抵抗〔7〕。機體血糖升高后，過量的ROS可以攻擊DNA產(chǎn)生的一種氧化性加合物——8-OHdG〔8〕。目前在評估體內(nèi)DNA氧化損傷的指標中，8-OHdG因其在體內(nèi)含量穩(wěn)定，且影響因素少，被公認為機體氧化損傷程度評價的理想標志物，可以利用ELISA、高壓液相、毛細管區(qū)帶電泳等方法對其進行檢測。

動物試驗證實，維生素D能夠調(diào)節(jié)糖尿病SOD、谷胱甘肽(GSH)抗氧化酶的活性〔9〕。在2015年對愛爾蘭人群的研究發(fā)現(xiàn)，VDR Bsml位點Fokl基因的多肽性與氧化應(yīng)激有關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果表明中國吉林地區(qū)漢族人群T2DM VDR Bsml位點B等位基因者更易加重氧化應(yīng)激的發(fā)生。

在T2DM及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展中已經(jīng)明確了氧化應(yīng)激機制的重要作用，關(guān)于T2DM慢性并發(fā)癥的很多研究進行了關(guān)于維生素D水平與氧化應(yīng)激關(guān)系的探討。分別對T2DM視網(wǎng)膜病變患者和T2DM腎病患者進行的研究結(jié)果均提示糖尿病患者存在氧化應(yīng)激損傷,且25羥維生素D3水平下降〔11,12〕。具有和膽固醇相似結(jié)構(gòu)的維生素D，在基礎(chǔ)研究中已經(jīng)證實具有與維生素E相等甚至更強的抗氧化作用，抗氧化的維生素具有激活免疫系統(tǒng)和抵抗基因遺傳改變的多種生物活性，可以阻止由ROS誘導(dǎo)的DNA損傷。維生素D的抗氧化能力由調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激中自由基的形成及上調(diào)GSH過氧化氫酶和SOD所激活〔13〕。研究表明，1,25二羥維生素D3可能通過VDR介導(dǎo)的途徑來調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞解耦聯(lián)蛋白2的表達，并抑制高糖誘導(dǎo)下的氧化應(yīng)激反應(yīng)〔14〕。目前關(guān)于如何調(diào)節(jié)T2DM VDR Bsml位點B等位基因的表達以減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，有待于進一步的研究。