孫嘉，黃藝，韓萍，李婉娟，楊大佐，喬寧，劉珍伶，趙歡

(大連海洋大學 遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧 大連 116023)

苯并(a)芘[benzo(a)pyrene， B(a)P]是一類廣泛存在于水體中的環(huán)境污染物，來源于石油海上開采和運輸過程中的泄露，以及生活污水和工業(yè)污水的排放等。B(a)P的親脂性使其極易進入水生生物體內(nèi)，引起組織損傷和氧化應激反應，目前，在貝類、魚類等多種水生生物中已有相關(guān)報道，如櫛孔扇貝Chlamysfarreri暴露于10 μg/L B(a)P 20 d后，其鰓絲上皮細胞膜出現(xiàn)破裂，表現(xiàn)出明顯的細胞損傷[1]；鯉暴露于含有0.1～1.0 μg/L B(a)P的水體30 d后，其肝、腎組織的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽酶(GSH)活性均降低，并出現(xiàn)組織損傷[2]；極地鱈Boreogadussaida連續(xù)投喂含20.3 μg/g B(a)P的飼料14 d后，其肝臟中檢測出B(a)P生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵產(chǎn)物[3-hydroxybenzo(a)pyrene，3-OH-BaP]的存在，表明B(a)P誘導極地鱈魚肝臟產(chǎn)生氧化應激反應[3]。B(a)P進入生物體內(nèi)可通過芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor， AHR)介導調(diào)控通路對機體產(chǎn)生氧化應激反應，近期研究發(fā)現(xiàn),包括B(a)P在內(nèi)的多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)的芳香烴分子結(jié)構(gòu)含有G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)配體，推測G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號調(diào)控通路也可能參與調(diào)控多環(huán)芳烴對機體的毒性效應[4-8]。

G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號調(diào)控通路通過外源及內(nèi)源性刺激信號與GPCRs的識別，活化G蛋白，從而影響細胞內(nèi)包括cAMP(Cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate)信號通路在內(nèi)的多種信號調(diào)控通路。cAMP信號通路也稱PKA系統(tǒng)(Protein kinase A system, PKA)，當外界信號刺激或細胞內(nèi)代謝條件發(fā)生變化，Gɑ亞基的首要效應酶——腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)的表達隨之發(fā)生變化，致使胞內(nèi)內(nèi)環(huán)腺苷3′,5′-單磷酸腺苷(cAMP)水平發(fā)生變化，從而引起細胞反應[9-10]。有報道表明，水溶性毛喉素類似物NKH 477(water-soluble forskolin analogue)(0.1～150 μm)會刺激蜜蜂ApismelliferaAC2t、AC8基因的熒光強度呈劑量依賴性增加，促進機體cAMP的生成[11]。注射嗎啡后，短時間內(nèi)小鼠AC活性及cAMP水平會有所降低，但隨著時間的延長，小鼠AC活性和cAMP水平逐漸升高[12]。目前，關(guān)于AC的研究多集中在脊椎動物中，而對其他無脊椎動物的相關(guān)報道相對較少。

多毛類動物生活在沿海的沉積質(zhì)中，屬于底棲無脊椎動物[13]，是海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)中的重要組成成員。目前，關(guān)于持久性有機污染物對多毛類的毒性效應研究大多集中于解毒代謝及抗氧化相關(guān)調(diào)控因子方面，關(guān)于持久性有機污染物對多毛類G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號調(diào)控通路的研究較少。本實驗室前期克隆獲得了雙齒圍沙蠶PerinereisaibuhitensisG蛋白α亞基(Gα)和GPCR基因，并發(fā)現(xiàn)雙酚A(bisphenol A，BPA)或 B(a)P可誘導Gα和GPCR基因的表達，隨暴露時間的延長，兩個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，推斷G蛋白偶聯(lián)受體介導的信號調(diào)控通路可能參與外源物質(zhì)對沙蠶的毒性效應[14-15]。為了進一步探討G蛋白偶聯(lián)受體介導調(diào)控通路在雙齒圍沙蠶對有機污染物毒性響應中的作用，本研究中以 B(a)P為特征污染物，在獲得AC基因cDNA全長序列的基礎(chǔ)上，分析了B(a)P誘導下雙齒圍沙蠶AC基因表達及AC酶活性變化，旨在為深入研究B(a)P對多毛類動物的毒性效應機制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雙齒圍沙蠶購自遼寧省大連市黑石礁小夏漁具店，其體質(zhì)量為1.5～2.5 g，挑選有活力的完整個體于實驗室暫養(yǎng)一周，控制水溫為(18±0.5)℃，鹽度為31～32，pH值為8.25±0.10，每24 h換水一次。

試驗試劑：RNAisoTMPlus、PrimeScriptTMRT-PCR Kit、Premix Ex TaqTMHot Start Version、SMARTer?RACE(rapid amplification of cDNA ends) 5′/3′Kit、PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa公司；Trans 5α感受態(tài)細胞和pEASY-Blunt Cloning Vector購自全式金生物技術(shù)(大連)有限公司；TIANGEN?瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；腺苷酸環(huán)化酶(AC)酶聯(lián)免疫分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上?？婆d商貿(mào)有限公司；苯并(a)芘(純度≥96%)購自 Sigma 公司；丙酮(純度≥99.5%)購自天津市凱信化學工業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 將沙蠶整體用液氮進行研磨，稱取0.1 g樣品，用RNAisoTMPlus試劑提取總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用微量紫外分光光度計測定RNA的濃度，樣品于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙齒圍沙蠶ACcDNA全長序列的克隆 根據(jù)本實驗室雙齒圍沙蠶轉(zhuǎn)錄組文庫中已經(jīng)驗證的AC中間片段序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計RACE特異性引物，RACE引物如表1所示。利用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit，以“1.2.1”節(jié)中獲得的RNA為模板，合成3′ RACE 和5′RACE cDNA，以3′RACE cDNA 為模板進行AC3′RACE擴增，試驗采用巢式PCR方法。

表1 試驗用引物信息Tab.1 Primers used in the study

Outer PCR(Polymerase Chain Reaction)反應體系(共50 μL)包括：PCR-Grade Water 15.5 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，3′RACE cDNA 2.5 μL，10×UPM(Universal Primer A Mix)5.0 μL，AC-F1(10 μmol/L)1.0 μL。

Outer PCR反應程序：94 ℃下循環(huán)變性30 s，61.9 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸3 min，共進行35個循環(huán)。取 5.0 μL Outer PCR 產(chǎn)物加入245 μL TE緩沖液(Tris-EDTA buffer solution)，取5.0 μL稀釋后的Outer PCR 產(chǎn)物進行 Inner PCR。

Inner PCR反應體系(共50 μL)包括：Outer PCR 反應液 5.0 μL，PCR-Grade Water 17.0 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，Universal Primer Short (10 μmol/L)1.0 μL，AC-F2(10 μmol/L)1.0 μL。

Inner PCR反應條件：94 ℃下循環(huán)變性30 s，68 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸3 min，共進行20個循環(huán)。采用普通PCR方法進行AC5′RACE擴增，反應體系同Quter PCR。

5′RACE反應程序同Outer PCR(退火溫度為68 ℃)。取擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶切膠回收、轉(zhuǎn)化鏈接，選取陽性克隆送至寶生物工程(大連)有限公司測序。將3′和5′RACE擴增序列進行拼接獲得AC全長序列，進行生物信息學分析。

1.2.3AC序列分析 利用BioEdit軟件進行拼接分析，得到ACcDNA全長序列。利用NCBI ORF Finder程序?qū)ふ译p齒圍沙蠶AC基因的開放閱讀框，并翻譯成相應的氨基酸序列，利用ProtParam 軟件進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，利用PSORTⅡ軟件預測蛋白在細胞內(nèi)的位置，利用ScanProsite 軟件對氨基酸序列修飾位點進行分析，利用TMHMM 軟件進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的分析，利用SWISS-MODEL軟件預測氨基酸序列的二級和三級結(jié)構(gòu)。利用Clustal軟件對雙齒圍沙蠶多重序列進行比對，利用MEGA 5.0軟件采用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自檢重復為 1000 次。

1.2.4 B(a)P誘導試驗 試驗設4個B(a)P濃度，分別為0.5、5.0、10.0、50.0 μg/L，另設置丙酮溶劑對照組(100 μL/L)和海水空白對照組，每個濃度組設4個平行。將0.05 g B(a)P粉末定容于100 mL丙酮中，配制成0.5 g/L的母液備用。誘導試驗在玻璃燒杯(2 L)中進行，在各濃度組燒杯中注入1 L海水后，分別加入1、10、20、100 μL B(a)P母液混勻，配制試驗溶液。每個平行隨機挑選10條沙蠶進行試驗。試驗期間不投餌，每24 h更換一次海水。于試驗第4、7、14天時取樣，每次從每個燒杯中隨機取3條沙蠶，剪取體壁保存用于后續(xù)檢測。

1.2.5 實時熒光定量PCR 總RNA的提取方法同“1.2.1”節(jié)。利用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser進行樣品反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)實驗室前期研究結(jié)果[13]，選取β-actin作為內(nèi)參基因，引物信息見表1。使用SYBR GreenⅠ染料法進行熒光定量PCR，反應體系(共20 μL)包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。PCR反應程序：95 ℃下預變性 30 s；95 ℃下變性 5 s，60 ℃下退火34 s，共進行 40 個循環(huán)。反應結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行溶解曲線分析以確保特異性擴增。每個樣品設置3個重復，采用ABI 7500 Real-Time PCR儀(Applied Biosystems，美國)進行分析。實時熒光定量數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法進行計算。

1.2.6 AC酶活性測定 將沙蠶整體用液氮進行研磨，稱取0.1 g樣品，加入0.9 mL PBS(phosphate buffer saline)(pH 7.4)緩沖液，用勻漿器將樣品充分混勻，于4 ℃下離心20 min(2500 r/min)，吸取上清液，制成10%組織勻漿，冷凍備用。采用ELISA試劑盒測定AC酶活性，計算方法和原理均參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，對試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC基因cDNA序列特征分析

經(jīng)克隆獲得雙齒圍沙蠶AC序列全長為4900 bp，其中，5′端非編碼區(qū)為127 bp，3′端非編碼區(qū)為1536 bp，開放閱讀框為3237 bp，編碼1078個氨酸(GenBank登錄號：KX792262.1)。該氨基酸序列具有兩個保守的環(huán)化酶同源結(jié)構(gòu)域(Cyclase homology domains，CHDs)，分別位于274～458 aa和843～1040 aa(圖1)，在兩個環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域(Cyclase catalytic domain，CYCc)中分別具有保守的核酸結(jié)合位點——金屬結(jié)合位點和多肽結(jié)合位點。預測該蛋白相對分子質(zhì)量為122 595.92，理論等電點(pI)為8.70。使用 PSORTⅡ軟件對AC進行細胞內(nèi)定位預測，結(jié)果顯示，該蛋白位于細胞質(zhì)膜上的概率最高為69.6%，推測該蛋白存在于細胞質(zhì)膜上。對AC蛋白序列進行跨膜結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白具有2個明顯的跨膜區(qū)域，每個跨膜區(qū)域包括6個跨膜區(qū)(Transmembrane helixs，TM)，分別位于49～71、81～98、105～127、137～156、161～183、189～211、586～608、613～635、648～670、709～729、731～753、763～785 aa，這與細胞內(nèi)定位預測的結(jié)果相一致，表明該蛋白屬于膜蛋白。使用SOPMA軟件對該蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果顯示，該蛋白由47.03% α-螺旋、9.83% β-轉(zhuǎn)角、22.63%無規(guī)則卷曲和20.50%延伸鏈組成。使用SWISS-MODEL軟件進行蛋白三級結(jié)構(gòu)預測，該蛋白包含由兩個βαββαβ二級結(jié)構(gòu)基序組成的掌狀結(jié)構(gòu)域(見電子版附圖1)。

2.2 AC氨基酸多重序列比對及系統(tǒng)進化分析

將雙齒圍沙蠶與其他物種AC氨基酸序列進行多重比對，結(jié)果顯示，雙齒圍沙蠶AC氨基酸序列在保守的環(huán)化酶催化結(jié)構(gòu)域部分與其他物種同源性較高，在其他區(qū)域同源性較低(見電子版附圖2)。雙齒圍沙蠶AC序列與軟體動物門的福壽螺Pomaceacanaliculata、長牡蠣CrassostreagigasAC1的一致性最高，為47%，與蝦夷扇貝MizuhopectenyessoensisAC的一致性為46%，與節(jié)肢動物門的天牛Anoplophoraglabripennis、溫帶臭蟲Cimexlectularius、鱟Limuluspolyphemus、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、溫室擬肥腹蛛Parasteatodatepidariorum、果蠅Drosophilaficusphila、家蠶Bombyxmori和南美白對蝦PenaeusvannameiAC序列的一致性為41%～45%，與高等脊椎動物大刺鰍Mastacembelusarmatus、大西洋鯡Clupeaharengus、青鳉Oryziaslatipes、白喉帶鹀Zonotrichiaalbicollis、大山雀Parusmajor和鼴鼠FukomysdamarensisAC序列的一致性為34%～37%，稍低于無脊椎動物。

對雙齒圍沙蠶AC氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析(圖2)，其中，無脊椎動物與脊椎動物分為兩大支，雙齒圍沙蠶AC在無脊椎動物分支中首先與軟體動物聚為一支，后與節(jié)肢動物聚為一大支。

2.3 B(a)P誘導下AC基因的表達

從圖3可知：試驗過程中，丙酮溶劑對照組與空白對照組相對表達量均無顯著性差異(P>0.05)，表明丙酮作為溶劑對試驗結(jié)果無影響；隨著誘導時間的延長，各B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC基因相對表達量呈不同的變化趨勢，0.5、10 μg/L濃度組呈先升高后下降，而5、50 μg/L濃度組則持續(xù)升高；暴露第4天時，0.5、5、10、50 μg/L濃度組雙齒圍沙蠶AC表達量較對照組升高，分別為空白對照組的1.46、3.01、3.17和1.36倍，且與空白對照組均無顯著性差異(P>0.05)；暴露第7天時，各B(a)P濃度組AC表達量較第4天時均有升高，分別為空白對照組的5.30、5.03、3.65和2.23倍，0.5、10 μg/L濃度組AC表達量達到最大值，其中，僅0.5 μg/L濃度組與空白對照組有顯著性差異(P<0.05)；暴露第14天時，5、50 μg/L濃度組AC表達量較第7天時有所升高并達到最大值，分別為空白對照組的5.45和2.89倍，僅5 μg/L濃度組與空白對照組有顯著性差異(P<0.05)，而0.5、10 μg/L濃度組AC表達量與第7天時相比略有下降。

2.4 B(a)P誘導下AC酶活性的變化

從圖4可見：各B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC酶活性隨誘導時間的延長呈波動變化趨勢；暴露第4天時，0.5、5、50 μg/L濃度組AC酶活性與空白對照組相比升高，并達到最大值，各濃度組分別為36.18、35.22、30.16 U/L，其中，0.5 μg/L濃度組與空白對照組有顯著性差異(P<0.05)，為空白對照組的1.28倍，而10 μg/L濃度組較空白對照組有所抑制，酶活性為25.40 U/L；暴露第7天時，各濃度組AC酶活性均高于空白對照組(P>0.05)，而10 μg/L濃度組AC酶活性較第4天時有所升高并達到最大值，為29.38 U/L；暴露第14天時，0.5、5 μg/L濃度組AC酶活性較第7天時有所升高，10、50 μg/L濃度組AC酶活性與第7天相比呈下降趨勢，但各濃度組AC酶活性與空白對照組均無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 AC基因的序列分析

腺苷酸環(huán)化酶(AC)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的重要信號分子，在外界信號刺激和細胞內(nèi)代謝變化的情況下，AC催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)分解生成第二信使cAMP。在正常情況下，細胞內(nèi)cAMP的濃度≤10-6mol/L，當AC被激活后，cAMP水平急劇增加，將信號傳導至下游調(diào)節(jié)各種生理過程，使靶細胞產(chǎn)生快速應答機制[16]。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)了10種AC異構(gòu)體(isoforms)，其中，AC1～AC9是跨膜AC(transmembrane ACs,tmACs)亞家族，其活性主要通過細胞外激素和神經(jīng)遞質(zhì)激活G蛋白耦連受體后，由異體G蛋白調(diào)節(jié)[17]；AC10屬于可溶性AC(soluble,sAC)，由AC10基因編碼[18]，其游離于細胞質(zhì)及其包含的亞細胞器中[19-20]。在蛋白結(jié)構(gòu)特征中所有AC均含有2個高度同源的環(huán)化酶同源結(jié)構(gòu)域CHDs和2個由跨膜α-螺旋組成的整合結(jié)構(gòu)域(TM1-TM6和TM7-TM12)，這些結(jié)構(gòu)交錯排列形成CHD-TM結(jié)構(gòu)單元。AC的催化結(jié)構(gòu)域位于胞質(zhì)區(qū)，有高度相似的三級結(jié)構(gòu)，進而形成一個對稱的界面(pseudosymmerical interface)，并在界面上由兩者的互補殘基共同參與構(gòu)成了AC催化活性位點。對本研究中克隆得到的雙齒圍沙蠶AC進行基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列同樣含有兩個保守的CHDs，分別位于274～458 aa和843～1040 aa，證實獲得的氨基酸序列屬于AC。在該蛋白序列的保守CHD1中還發(fā)現(xiàn)，存在于其他物種氨基酸序列的兩個保守金屬離子結(jié)合位點Asp288和Asp332，該位點在催化過程中通過結(jié)合作為輔助因子的Mg2+或Mn2+啟動催化反應。

同源序列比對顯示，雙齒圍沙蠶AC氨基酸序列與其他物種的一致性為34%～47%，其中，在環(huán)化酶同源區(qū)域同源性較高，而在其他區(qū)域同源性較低。環(huán)化酶同源區(qū)域的高同源性表明，AC氨基酸主要功能區(qū)域在不同物種中相對比較保守，而在其他區(qū)域的低同源性可能與不同物種AC功能的差異存在一定的相關(guān)性。研究表明，不同亞型跨膜ACs保留在細胞質(zhì)中的肽鏈N-端和C-端的序列和長度差別比較明顯，這些區(qū)域的差別可能與不同亞型跨膜AC的靶向定位及寡聚化的差別有關(guān)[21]。本研究中得到的雙齒圍沙蠶AC氨基酸與其他物種AC氨基酸序列在其他區(qū)域的差別表明，其在雙齒圍沙蠶中的功能可能與其他物種存在一定差異。多重序列比對顯示，該蛋白序列與軟體動物門AC序列的同源性較高，基因結(jié)構(gòu)分析亦顯示，蛋白序列中具有多個鈣調(diào)蛋白(CaM)共識位點。哺乳動物中已鑒定的9種AC亞型，根據(jù)AC各個膜型的調(diào)節(jié)特點可分為4組，其中，AC1、AC3和AC8屬于第1組，它們可以由鈣活化的CaM誘導激活[22]。由此推測，本研究發(fā)現(xiàn)的雙齒圍沙蠶AC蛋白可能亦屬于第1組AC。而不同物種AC1到AC8在結(jié)構(gòu)上具有較高相似性，肽鏈N-端和C-端序列及長度的差別會造成其功能的差異性，故需通過進一步相關(guān)AC功能驗證分析來最終確定AC蛋白的類別。

3.2 污染物脅迫對雙齒圍沙蠶AC基因及AC酶活性表達的影響

AC是cAMP信號通路的主要調(diào)控因子，AC活性的改變會影響細胞內(nèi)cAMP的水平，從而調(diào)節(jié)機體生理過程。有研究表明,在貝類應對污染物及環(huán)境因子等脅迫時AC/cAMP調(diào)控通路能夠發(fā)揮重要作用[23]。如Li等[24]發(fā)現(xiàn),酸化會激活牡蠣Pinctadafucata體內(nèi)cAMP信號通路中AC、cAMP和PKA等的表達，以此應對機體化學平衡的變化。Fabbri等[25]發(fā)現(xiàn),紫貽貝Mytilusgalloprovincialis暴露于10 ng/L Cr6+和5 μg/L Cu2+7 d后，其鰓組織中AC酶活性及cAMP含量升高。同貝類一樣，本研究中，B(a)P脅迫下的雙齒圍沙蠶AC基因表達及酶活性均出現(xiàn)不同程度的升高，在一定程度上可以說明有機污染物會引起多毛類體內(nèi)AC/cAMP調(diào)控通路發(fā)生改變。但本研究中B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC基因及酶活性變化與對照組無顯著性差異，分析引起這一現(xiàn)象的原因可能與試驗個體對持久性有機污染物耐受性差異有關(guān)。有學者研究表明，重金屬污染嚴重地區(qū)的沙蠶種群對污染物具有異常的適應性和高度耐性[26]，故作者認為多毛類能夠?qū)C的變化表現(xiàn)出較強的適應性和耐性。

此外，本研究結(jié)果顯示，50 μg/L B(a)P濃度組雙齒圍沙蠶AC基因表達在誘導前7 d低于其他3個濃度組，AC酶活性在誘導第4天和第14天時低于0.5、5 μg/L B(a)P濃度組。這與很多關(guān)于重度逆境脅迫會導致機體抗氧化酶和解毒代謝酶基因表達、酶活性均降低的研究結(jié)果相似，如多齒圍沙蠶在B(a)P誘導下CYP3A基因在 50 μg/L B(a)P濃度組的表達量顯著低于2.5 μg/L B(a)P濃度組[27]；菲和芘單一污染會脅迫蚯蚓EiseniafoetidaSOD活性表現(xiàn)為低劑量激活、高劑量抑制[28]。由此推測，雙齒圍沙蠶在高濃度B(a)P誘導下會對機體造成損傷，致使AC基因表達和AC酶活性變化相較于低濃度B(a)P誘導呈抑制現(xiàn)象。

對比本研究中AC基因表達和AC酶活性變化的結(jié)果可以看出，10 μg/L濃度組雙齒圍沙蠶AC酶活性的變化規(guī)律與AC基因表達變化趨勢相同，而0.5、5、50 μg/L濃度組AC酶活性與AC基因表達呈現(xiàn)不同的變化趨勢。B(a)P誘導下雙齒圍沙蠶ACmRNA表達量變化與酶活性變化呈現(xiàn)出不一致性，推測可能是因為包括mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后修飾等因素都會影響蛋白表達，這可能造成酶活性變化與mRNA表達水平的不一致[29]；亦或者是因為受到污染后AC活性最先被誘導，隨后基因被誘導表達，呈現(xiàn)出時間上的差異。關(guān)于雙齒圍沙蠶AC酶活性與基因編碼調(diào)控間的相互作用機制，今后將進行更深入的研究。

4 結(jié)論

(1)本研究中首次克隆獲得了雙齒圍沙蠶AC基因全長序列，該基因全長4900 bp，編碼1078個氨基酸，該序列屬于第1組AC。

(2)B(a)P誘導可以上調(diào)雙齒圍沙蠶AC基因表達并激活AC酶活性，而高濃度B(a)P會對雙齒圍沙蠶產(chǎn)生重度脅迫。本研究表明，持久性有機污染物B(a)P會引起多毛類動物體內(nèi)AC/cAMP調(diào)控通路發(fā)生改變，從而促進多毛類動物對環(huán)境變化的適應。