于靜芳，尹潤(rùn)竹，周 俊

(華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所暨激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)最早是由德國(guó)化學(xué)家Dann[1]在尋找新的抗錐蟲藥物時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種二脒類化合物。研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)DAPI結(jié)合在DNA上時(shí)熒光顯著增強(qiáng)，尤其對(duì)富含A-T序列的DNA具有很高的吸附能力[2]。進(jìn)一步的研究揭示,DNA酶能嚴(yán)重削弱DAPI的熒光，而RNA酶則對(duì)其無(wú)明顯影響[3]。這些試驗(yàn)結(jié)果引起了該領(lǐng)域其他科學(xué)家的注意，DAPI作為一種DNA特異性熒光染料的應(yīng)用得到了進(jìn)一步探索。隨后，DAPI在熒光顯微觀察細(xì)菌[4]、植物[5,6]和哺乳動(dòng)物細(xì)胞[7,8]DNA中的實(shí)用性被證明。DAPI作為DNA染料具有優(yōu)良的性能，它以二氯化物或二乙酸鹽的固態(tài)形式，在黑暗中可以保存數(shù)年而不分解[9]。此外，DAPI易溶于水，在水溶液中能穩(wěn)定保存數(shù)月。DAPI溶液的吸收光譜中有3個(gè)吸收峰，分別在222、259、340 nm。自由染料形式的DAPI熒光量子產(chǎn)率很低，最大熒光發(fā)射峰為453 nm。當(dāng)DAPI與DNA結(jié)合時(shí)，最大激發(fā)峰發(fā)生紅移，發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移，熒光量子產(chǎn)率增加近20倍[9]。

隨著DAPI廣泛用于生物染色和DNA分析，其與核酸相互作用的機(jī)制也逐漸被闡明。早期研究認(rèn)為DAPI形成熒光復(fù)合物需特異性要求雙鏈DNA并富含A-T堿基序列[1,3]，后來(lái)發(fā)現(xiàn)單鏈和雙鏈RNA都能夠與DAPI形成復(fù)合物，但是這些復(fù)合物的熒光比DAPI結(jié)合雙鏈DNA的熒光要弱很多[10]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)DAPI并不是直接插入到DNA中，而是結(jié)合到B型DNA小溝(minor groove)中[11]。該熒光復(fù)合物與天然DNA分子幾乎具有相同構(gòu)象，每個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)有1個(gè)DAPI和25個(gè)水分子[11]。DAPI沿邊緣結(jié)合到狹窄的DNA小溝中，展現(xiàn)出有序的水合脊柱(hydration spine)。DAPI和單個(gè)水分子一起跨越了DNA雙鏈中心的4個(gè)A-T堿基對(duì)。其中，DAPI的吲哚氮與2個(gè)中心堿基對(duì)的胸腺嘧啶氧原子形成1個(gè)交叉的氫鍵[11]。DAPI優(yōu)先結(jié)合A-T堿基區(qū)域的原因在于：1)相比于G-C堿基區(qū)域，A-T堿基區(qū)域形成的小溝較窄，導(dǎo)致小溝壁之間扁平芳香環(huán)的緊密契合；2)由于缺乏陽(yáng)性的鳥嘌呤，A-T堿基區(qū)域的小溝具有更多的負(fù)向靜電勢(shì)[9]。堿基對(duì)之間的溝槽寬度和靜電因素是導(dǎo)致DAPI偏愛(ài)結(jié)合A-T堿基區(qū)域的重要原因。

目前，DAPI作為一種細(xì)胞核熒光染料，在植物不同組織染色中的應(yīng)用仍缺乏比較系統(tǒng)的表征。本文,我們構(gòu)建了核定位的BAG5-eYFP轉(zhuǎn)基因植物，探究了植物不同組織響應(yīng)DAPI染色的差異情況。研究結(jié)果顯示，非化學(xué)固定的植物葉片表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞能被DAPI染色，二者對(duì)于活體細(xì)胞核的功能研究將會(huì)是很好的模型。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

植物的培養(yǎng)同之前方法[12,13]，野生型(Columbia-0)、線粒體marker CoxIV-RFP及轉(zhuǎn)基因UBQ10∶BAG5-eYFP擬南芥種子經(jīng)75%乙醇(含0.05% Triton X-100)震蕩消毒10 min，隨后于超凈臺(tái)中用100%乙醇置換，并轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上，干燥15～20 min后，撒種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上。4 ℃冰箱中黑暗處理2 d，然后放置于人工培養(yǎng)箱，光周期為16 h(光)/8 h(暗)，晝夜溫度為23 ℃(晝)/21 ℃(夜)，生長(zhǎng)5 d的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建

雙元載體121-UBQ10∶BAG5-eYFP-NOS采用片段同源重組方法，過(guò)程簡(jiǎn)述如下：121-UBQ10∶MCS-eYFP-NOS(由本實(shí)驗(yàn)室改造保存)經(jīng)BamH I(NEB)和KpnI(NEB)酶切，膠回收后獲得線性化載體，-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增得到擬南芥BAG5 cDNA片段，引物為：BAG5-F：tttctgattaacagggatccATGAAACG TTCAAGAAAATTCT；BAG5-R：tcaccatcccgggggtaccTTCT CTGAGAAATCTCTGGAAAC(小寫為載體同源序列)。利用試劑盒[ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme, Nanjing)]完成線性化載體和BAG5cDNA片段的重組。挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)BAG5序列是否正確。

UBQ10∶BAG5-eYFP轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)蘸花法獲得，過(guò)程簡(jiǎn)述如下：利用電擊法將質(zhì)粒121-UBQ10∶BAG5-eYFP-NOS轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV1301中；菌落PCR驗(yàn)證，選取陽(yáng)性克隆，LB液體培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平)擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心3 min；菌體用5%蔗糖(0.01% Silwet L-77)重懸，蘸花于5周齡的擬南芥，重復(fù)4次，每周1次。收獲的種子在MS培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那霉素)上篩選，挑取抗性植物并經(jīng)熒光顯微鏡確認(rèn)熒光，第三代(F3)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 DAPI處理

DAPI(CAT #D9542)購(gòu)置于Sigma公司。用0.1 mol/L磷酸鹽(pH 7.4)配置成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的工作液，儲(chǔ)存于4 ℃。取培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)5 d的擬南芥幼苗置于上述DAPI染色液中，20 min后用去離子水沖洗3次。多聚甲醛固定處理步驟如下：用0.1 mol/L磷酸鹽配置4%多聚甲醛，先加入NaOH使其充分溶解，后用HCl將pH調(diào)回到7.4。取苗齡為5 d的擬南芥幼苗置于上述固定液中2 h，去離子水沖洗3次，再置于DAPI染色液中浸染20 min。

1.4 激光共聚焦成像

激光共聚焦參考之前方法[14-16]。挑取DAPI染色20 min的植物幼苗，ddH2O沖洗3次，置于載玻片上；倒置于LSM880型激光共聚焦掃描顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSM880，ZEISS)載物臺(tái)上，選取63倍油鏡，檢測(cè)觀察幼苗根部、下胚軸、葉片等組織部位。DAPI激發(fā)光為405 nm，熒光的采集波段為435～500 nm；eYFP激發(fā)光為514 nm，熒光的采集波段為518～550 nm；CoxIV-RFP的激發(fā)光波長(zhǎng)為561 nm，熒光的采集波段為580～620 nm；葉綠素激發(fā)光為488 nm，熒光的采集波段為650～720 nm。采用Zen 2.5軟件系統(tǒng)分析試驗(yàn)圖像和數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活體植物的葉片表皮細(xì)胞核能被DAPI染色

為了探究DAPI染色在植物中的應(yīng)用，我們首先構(gòu)建了UBQ10∶BAG5-eYFP轉(zhuǎn)基因植物。從圖1中可看出eYFP的熒光主要出現(xiàn)在各組織的細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果，我們對(duì)各組織活體細(xì)胞進(jìn)行了DAPI染色。結(jié)果顯示不同組織響應(yīng)DAPI染色表現(xiàn)出很大的差異(圖1)。保衛(wèi)細(xì)胞(guard cell)、根部分生區(qū)細(xì)胞(root meristem)和根毛(root hair)的細(xì)胞核較難染色，而葉片下表皮細(xì)胞(epidermal cell)和下胚軸細(xì)胞(hypocotyl cell)的細(xì)胞核能夠較易被DAPI染色(圖1)。相比于下表皮細(xì)胞，根部的熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞壁區(qū)域(圖1)，說(shuō)明DAPI很難跨過(guò)根部細(xì)胞膜進(jìn)入活體細(xì)胞。值得注意的是，在葉片下表皮和下胚軸細(xì)胞中有一些點(diǎn)狀的熒光信號(hào)，推測(cè)其可能為線粒體DNA。

2.2 活體植物的線粒體能被DAPI染色

為了驗(yàn)證圖1中點(diǎn)狀熒光是否為線粒體，我們對(duì)內(nèi)源表達(dá)的線粒體分子標(biāo)記植物35S∶CoxIV-RFP進(jìn)行了DAPI染色。圖2顯示CoxIV-RFP和DAPI的熒光具有很好的共定位，說(shuō)明這些小的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)應(yīng)為線粒體。接下來(lái)我們探究了同樣具有DNA的植物細(xì)胞器葉綠體是否能被DAPI染色。從圖2中可以看出，葉肉細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核都能被DAPI染色，說(shuō)明DAPI能夠進(jìn)入該活體組織細(xì)胞。然而，DAPI的熒光并不能和葉綠體自發(fā)熒光共定位。因此，不同亞細(xì)胞器線粒體和葉綠體對(duì)DAPI染色同樣表現(xiàn)出很大差異。

圖1 擬南芥不同組織響應(yīng)DAPI染色的差異Fig.1 Differential responses of DAPI staining in different tissues of Arabidopsis5 d苗齡的UBQ10∶BAG5-eYFP穩(wěn)轉(zhuǎn)基因植物在DAPI染色液中浸染20 min，去離子水沖洗3遍后，激光共聚焦檢測(cè)各組織區(qū)域。比例尺為20 μm5-day old UBQ10∶BAG5-eYFP stable transgenic plants were stained with DAPI for 20 min. After washed with ddH2O three times, the different tissues were detected by confocal microscopy.Bar=20 μm

2.3 多聚甲醛固定促進(jìn)DAPI在根部和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的染色

DAPI穿透活細(xì)胞膜是濃度依賴性的，它通常被認(rèn)為是半通透性染料。我們隨后探究了多聚甲醛固定之后對(duì)植物組織DAPI染色的影響。5 d苗齡的轉(zhuǎn)基因植物UBQ10∶BAG5-eYFP在4%多聚甲醛溶液中固定2 h。共聚焦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，保衛(wèi)細(xì)胞、根部分生區(qū)及過(guò)渡區(qū)的細(xì)胞核在固定之后能夠被DAPI染色(圖3)。但值得注意的是，化學(xué)固定使得BAG5-eYFP的熒光出現(xiàn)不同程度的彌散情況。因此，在探究細(xì)胞核的功能研究時(shí)應(yīng)充分考慮化學(xué)固定因素對(duì)蛋白定位的影響。

圖2 線粒體和葉綠體響應(yīng)DAPI染色的差異Fig.2 Different responses of DAPI staining between mitochondria and chloroplast5 d苗齡的線粒體marker 35S∶CoxIV-RFP穩(wěn)轉(zhuǎn)基因植物葉片在DAPI染色液中浸染20 min，去離子水沖洗3遍后，激光共聚焦檢測(cè)葉片下表皮和葉肉細(xì)胞。比例尺為20 μmThe leaf of 5-day old 35S∶CoxIV-RFP transgenic plants were stained with DAPI for 20 min. After washed with ddH2O three times, the leaf abaxial epidermis and mesophyll cells were examined by confocal microscopy. Bar=20 μm

圖3 多聚甲醛固定后不同組織的DAPI染色Fig.3 DAPI staining of different tissues after fixed with paraformaldehydeUBQ10∶BAG5-eYFP轉(zhuǎn)基因植物在4%多聚甲醛中固定2 h，去離子水沖洗3遍后，在DAPI染色液中浸染20 min，激光共聚焦檢測(cè)各組織區(qū)域。比例尺為20 μmThe UBQ10∶BAG5-eYFP transgenic plants were fixed in 4% paraformaldehyde for 2 hours. After washed with ddH2O three times, the plants were immersed in DAPI solution for 20 min. Different tissues were examined by confocal microscopy. Bar=20 μm

3 討論

DAPI是一種常用的細(xì)胞核標(biāo)記熒光染料，它可與雙鏈DNA相結(jié)合，用于指示化學(xué)固定細(xì)胞的細(xì)胞核。DAPI通常被認(rèn)為是半膜通透性染料，因?yàn)樗┩富畹募?xì)胞膜具有濃度依賴性[17]。在比較低的濃度時(shí)，它基本上被排除在活細(xì)胞之外；而在較高濃度時(shí)，它對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞的染色程度大致相同[17]。本文構(gòu)建了一個(gè)細(xì)胞核定位的BAG5-eYFP轉(zhuǎn)基因植物，首次比較系統(tǒng)地探究了模式植物擬南芥各組織細(xì)胞對(duì)DAPI染色的響應(yīng)情況。結(jié)果顯示,在相同濃度的DAPI下，活細(xì)胞中的染色差異主要取決于不同組織細(xì)胞類型。生物細(xì)胞膜主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，一定的膜流動(dòng)性及通透性與物質(zhì)和能量交換、信息分子傳遞等多種生物功能具有密切聯(lián)系[18,19]，這對(duì)維持細(xì)胞正常生理代謝功能具有重要的意義。不同組織細(xì)胞在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育中扮演不同的角色和功能，細(xì)胞膜通透性的不同可能是導(dǎo)致其對(duì)DAPI染色表現(xiàn)出較大差異的重要原因。

作為半自主性細(xì)胞器，線粒體和葉綠體都具有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)DNA。我們發(fā)現(xiàn)線粒體DNA較易被DAPI染色，而同一細(xì)胞中的葉綠體則不能被DAPI染色。A-T堿基對(duì)之間較小的溝槽寬度和負(fù)向靜電勢(shì)，使得DAPI偏愛(ài)結(jié)合DNA的A-T堿基區(qū)域[9]。而線粒體DNA序列富含A-T堿基[20]，這可能是其相對(duì)于葉綠體較易被染色的主要原因之一。線粒體和葉綠體都是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器。但不同于葉綠體，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)存在質(zhì)子及其他離子濃度不對(duì)稱分布而形成的膜電位[21]。后者是很多染料分子如羅丹明及其衍生物標(biāo)記識(shí)別線粒體的重要基礎(chǔ)。目前，對(duì)于膜電位是否能夠促進(jìn)DAPI的跨膜運(yùn)動(dòng)還有待進(jìn)一步證明。

相比于活體組織，多聚甲醛固定之后，根部分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞均能被DAPI染色。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞膜通透性是DAPI染色的關(guān)鍵。但是，我們發(fā)現(xiàn)多聚甲醛的固定導(dǎo)致BAG5-eYFP細(xì)胞核的熒光出現(xiàn)很大程度的彌散。由于化學(xué)固定往往殺死細(xì)胞，不利于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胞質(zhì)和核的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等動(dòng)態(tài)信息，因此，葉片表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞對(duì)于DAPI染色將會(huì)是很好的模型，這對(duì)于探究植物活體細(xì)胞核的功能研究具有重要意義。