王 瓊，李 丹，李金燕，胡冰杰，邱 燁，葛行義*

(1.醫(yī)學(xué)病毒學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南大學(xué)生物學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410082；2.中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所， 武漢 430071)

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)是一種空氣傳播的感染人類的高致病性病毒[1,2]。近20年的研究表明，SARS-CoV起源于蝙蝠SARS樣冠狀病毒(SARS-like coronavirus，SL-CoV)，可能的傳播進(jìn)化路徑是SL-CoV從蝙蝠傳播到中間宿主果子貍，進(jìn)而感染到人類[3-6]。冠狀病毒的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體，協(xié)調(diào)病毒入侵細(xì)胞，是病毒感染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵一步，是影響病毒宿主范圍和感染能力的重要因素[7,8]。SARS-CoV的S蛋白由2個(gè)亞基組成，即負(fù)責(zé)受體結(jié)合的S1和負(fù)責(zé)膜融合的S2，其中S1包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor-binding domain，RBD)，RBD負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合受體。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)具有羧肽酶活性，是SARS-CoV的功能受體[9]。研究表明，SARS-CoV和SL-CoV(如WIV1株)可以利用人、果子貍和蝙蝠ACE2進(jìn)入細(xì)胞，且能在動(dòng)物和人類細(xì)胞中有效復(fù)制[6,9]。此外，SARS-CoV能夠低效利用小鼠ACE2，而不能有效利用大鼠ACE2[10]。SL-CoV WIV1與SARS-CoV基因組結(jié)構(gòu)特征相似，雖然SL-CoV WIV1與SARS-CoV的s基因高度同源，但兩者在RBD的關(guān)鍵氨基酸(amino acid,aa)殘基上仍有不同[11-13]。前期研究顯示,SL-CoV與SARS-CoV的S蛋白氨基酸位點(diǎn)變異會(huì)影響其抗體交叉保護(hù)能力、感染能力和致病性，但這些氨基酸位點(diǎn)的變化導(dǎo)致的與受體結(jié)合及細(xì)胞入侵效率的差異還沒有被明確揭示[14,15]。

嚙齒動(dòng)物是哺乳動(dòng)物中多樣性最高、數(shù)量最多、分布最廣的一個(gè)類群，小鼠也是使用最廣泛的試驗(yàn)動(dòng)物模型。先前的研究表明，適應(yīng)小鼠的SARS-CoV骨架中的WIV1嵌合病毒可以感染BALB/c小鼠，這表明SL-CoV WIV1可以入侵小鼠細(xì)胞[16]。在本研究中，我們通過假病毒感染系統(tǒng)比較了SARS-CoV和SL-CoV對(duì)人、果子貍、蝙蝠和小鼠ACE2以及ACE2突變體的利用效率；同時(shí)，通過蛋白結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證了SARS-CoV和SL-CoV RBD結(jié)合不同物種來源ACE2的能力；另外,鑒定出ACE2的L440P是一個(gè)新的影響S蛋白結(jié)合的重要氨基酸位點(diǎn)。研究結(jié)果表明,SL-CoV WIV1可以利用小鼠ACE2作為其功能受體，提示此類病毒能夠以小鼠為宿主，拓展了對(duì)此類宿主范圍的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎上皮細(xì)胞HEK293T、非洲綠猴腎細(xì)胞VERO-E6、宮頸癌細(xì)胞HeLa均來自于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(american type culture collection，ATCC)。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)買于Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 ACE2以及突變體載體構(gòu)建

從C57BL/6小鼠睪丸組織中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增獲得ACE2全長(zhǎng)，通過酶切酶連將其構(gòu)建至真核表達(dá)載體pcDNA3.1上，通過直接測(cè)序和克隆測(cè)序，鑒定小鼠ACE2上的F72S、W168R、L440P、F683S突變位點(diǎn)。其次，利用定點(diǎn)突變技術(shù)分別在人、蝙蝠、果子貍ACE2表達(dá)質(zhì)粒上進(jìn)行440位點(diǎn)單突變，hACE2-L440P、hACE2-L440H、hACE2-L440A、bACE2-L440P、cACE2-L440P。

1.2.2 蛋白免疫印跡

HeLa細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，USA)將表達(dá)ACE2及突變體的質(zhì)粒或者空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞用于免疫印跡分析。簡(jiǎn)單來說，細(xì)胞裂解后，用10%的SDS-PAGE膠分離蛋白并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，用5%的脫脂奶粉封閉，再用Anti-His小鼠單克隆抗體(1∶5 000，Bioworld，USA)孵育，之后用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠單克隆抗體(1∶5 000，Bioworld，USA)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 假病毒包裝

HEK293T細(xì)胞鋪至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，共轉(zhuǎn)染HIV骨架質(zhì)粒pNL4-3.Luc.R-E和表達(dá)質(zhì)粒S(pcDNA3.1-BJ01-S/WIV1-S/RP3-S-HA)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞上清，4 ℃，6 000 r/min離心15 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，分裝保存在-80 ℃。

1.2.4 假病毒感染試驗(yàn)

HeLa細(xì)胞接種于96孔板，18 h后，將表達(dá)ACE2及突變體的質(zhì)粒或pcDNA3.1空載對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗細(xì)胞1次，每孔加入100 μL假病毒，感染8 h后吸掉病毒液，更換新鮮培養(yǎng)基。病毒感染48 h后，移除培養(yǎng)基，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，搖床放置15 min，加入底物，測(cè)定熒光素酶活性值(Promega，USA)。

1.2.5 RBD蛋白表達(dá)和純化

HEK293T細(xì)胞鋪至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染RBD(317～569 aa)表達(dá)質(zhì)粒(pCAGGS-S-BJ01-RBD/WIV1-RBD/RP3-RBD)至細(xì)胞中。6 h后，更換無血清培養(yǎng)基(PRO-293 TGE CD)。48 h后，收集細(xì)胞上清，用0.45 μm濾膜過濾，然后加入S-protein Agarose(Novagen，China)室溫低速混勻1 h后過柱，用1×bind & wash buffer重懸蛋白填料，輕輕混勻，再用3 mol/L MgCl2洗脫目的蛋白。最后用10 kD超濾管(Millipore，USA)超濾濃縮，將目的蛋白溶于PBS中，分裝保存于-20 ℃。

1.2.6 蛋白結(jié)合檢測(cè)

HeLa細(xì)胞鋪至6孔板，18 h后將表達(dá)ACE2以及突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。48 h后用PBS清洗細(xì)胞1次，后用含有5 mmol/L EDTA二鈉鹽的PBS消化細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min。將純化的RBD目的蛋白5 μg與細(xì)胞在室溫下孵育1 h，用Anti-S鼠單克隆抗體(1∶1 000，Cell Signaling Technology，USA)孵育1 h。最后用含Alexa Fluor?488耦聯(lián)的羊抗鼠單克隆抗體室溫避光孵育1 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，F(xiàn)low Jo軟件分析蛋白與細(xì)胞的結(jié)合效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種ACE2氨基酸序列比較

為了探究SL-CoV WIV1和SARS-CoV BJ01利用鼠源ACE2的差異，本研究提取了小鼠的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR克隆獲得小鼠ACE2的CDS序列(NCBI序列號(hào)：NP_001123985.1)，ACE2 CDS區(qū)由2 418個(gè)核苷酸構(gòu)成，編碼806個(gè)氨基酸。將其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人(Homosapiens)、蝙蝠(Rhinolophussinicus)、果子貍(Pagumalarvata)的ACE2氨基酸序列(NCBI序列號(hào)分別為：NP_068576.1，AGZ48803.1，AAX63775.1)進(jìn)行比對(duì)分析(圖1)，結(jié)果表明，小鼠ACE2與人來源的ACE2相似性最高(82.11%)，其次是果子貍ACE2(81.61%)、蝙蝠ACE2(78.26%)。這些氨基酸序列的多樣性可能會(huì)影響病毒利用不同物種ACE2的能力，其中ACE2的18個(gè)氨基酸殘基通過氫鍵、鹽橋或多個(gè)范德華力與RBD區(qū)的14個(gè)氨基酸殘基相互作用。

2.2 ACE2以及ACE2突變體蛋白的表達(dá)

為了驗(yàn)證和比較SL-CoV WIV1和SARS-CoV BJ01結(jié)合利用不同物種ACE2的能力，本研究首先對(duì)ACE2的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),將分別表達(dá)人、蝙蝠、果子貍、小鼠ACE2及其突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測(cè)其表達(dá)情況。結(jié)果顯示，ACE2及其突變體蛋白均能在HeLa細(xì)胞中有效表達(dá),不同物種ACE2-L440P單突變和小鼠ACE2-F72S、W168R、F683S單突變蛋白表達(dá)水平較野生型ACE2未見明顯變化，而ACE2-L440H和L440A蛋白表達(dá)水平較野生型ACE2明顯降低(圖2)。

2.3 WIVI有效利用小鼠ACE2入侵細(xì)胞，且L440P突變嚴(yán)重抑制BJ01及WIV1感染

為了研究SARS-CoV BJ01以及SL-CoV WIV1利用不同物種ACE2及不同位點(diǎn)突變ACE2的入侵效率，我們開展了假病毒入侵試驗(yàn)。首先，對(duì)包裝的假病毒進(jìn)行檢測(cè)，通過蛋白免疫印跡檢測(cè)，在細(xì)胞上清中發(fā)現(xiàn)了單一的特異性S、HIV-P24蛋白條帶，這表明SARS-CoV BJ01、SL-CoV WIV1、SL-CoV RP3假病毒包裝成功(圖3a)。接著，假病毒入侵及熒光素酶活性分析數(shù)據(jù)顯示，BJ01和WIVI假病毒能感染易感細(xì)胞VERO-E6，而RP3假病毒不能感染，這與之前的研究是一致的(圖3b)。入侵效率比較試驗(yàn)中，用含S蛋白的假病毒感染瞬時(shí)表達(dá)ACE2及其突變體的HeLa細(xì)胞，RP3假病毒感染作為陰性對(duì)照(圖3c)。

圖1 不同物種ACE2氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Homology comparison of different species ACE2hACE2：人ACE2；cACE2：果子貍ACE2；bACE2：蝙蝠ACE2；mACE2：小鼠ACE2。*為重要的氨基酸位點(diǎn)；#為本文突變位點(diǎn)hACE2:Human ACE2;cACE2:Civet ACE2;bACE2:Bat ACE2;mACE2:Mouse ACE2. * Important amino acid site; # Mutation sites in this study

圖2 ACE2在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of ACE2 in HeLa cells

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，BJ01和WIVI假病毒均能入侵表達(dá)人、果子貍、蝙蝠和小鼠ACE2的HeLa細(xì)胞系，但是SARS-CoV BJ01入侵蝙蝠ACE2的HeLa細(xì)胞系能力較弱,而WIVI與BJ01利用小鼠ACE2的能力等同于利用人及果子貍ACE2的能力，證實(shí)了WIV1可以高效利用小鼠ACE2作為其功能受體。此外，小鼠ACE2的F72S、W168R、F683S突變對(duì)假病毒入侵效率基本沒有影響，而小鼠L440P突變則顯著降低了假病毒入侵效率(圖3c),這表明小鼠ACE2的440位點(diǎn)對(duì)于病毒入侵是至關(guān)重要的。為了進(jìn)一步揭示不同物種ACE2-440位點(diǎn)突變是否也會(huì)降低SARS-CoV BJ01以及SL-CoV WIV1的入侵效率，本研究針對(duì)人ACE2-440位點(diǎn)進(jìn)行突變，包括L440P、L440H、L440A，對(duì)蝙蝠和果子貍ACE2的440位點(diǎn)進(jìn)行L440P突變。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同物種ACE2的L440P突變均能顯著降低假病毒入侵效率，而人源ACE2的L440H、L440A單堿基突變對(duì)假病毒入侵效率沒有顯著影響，證實(shí)了ACE2的L440P突變是影響病毒入侵的關(guān)鍵氨基酸突變，能顯著降低病毒對(duì)受體的利用效率，L440P可能是病毒結(jié)合受體的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖3 假病毒感染試驗(yàn)Fig.3 Pseudovirus infection assay(a)蛋白免疫印跡檢測(cè)s基因的表達(dá)；(b)熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證BJ01、WIV1、RP3假病毒入侵易感細(xì)胞VERO-E6；(c)熒光素酶試驗(yàn)比較BJ01、WIV1、RP3假病毒入侵表達(dá)人、果子貍、蝙蝠、鼠ACE2及L400P突變體細(xì)胞效率(a)Detection of the expression of s gene detectd by western-blot;(b)Luciferase assay measures BJ01、WIV1、RP3 pseudovirus entry into susceptible cells VERO-E6;(c)Luciferase assay compares the efficiency of BJ01、WIV1、RP3 pseudovirus entry into HeLa cells expressing human, civet, bat, mouse ACE2, or ACE2-L400P

2.4 ACE2蛋白表達(dá)及純化

為了進(jìn)一步研究SARS-CoV BJ01和SL-CoV WIV1的S蛋白結(jié)合不同物種ACE2的能力，首先以全長(zhǎng)s基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增其與受體結(jié)合的RBD區(qū)域，N端融合信號(hào)肽和S-tag，克隆至真核表達(dá)載體pCAGGS上。隨后在HEK293T細(xì)胞表達(dá)并純化出SARS-CoV BJ01、SL-CoV WIV1和RP3的S1-RBD蛋白。SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，三種RBD蛋白均能有效表達(dá)并分泌到HEK293T細(xì)胞上清中，且能夠大量純化出有活性的RBD蛋白(圖4)。

2.5 RBD和ACE2結(jié)合能力比較

為了進(jìn)一步確定不同物種ACE2 L440P位點(diǎn)的突變對(duì)SARS-CoV BJ01以及SL-CoV WIV1的RBD區(qū)的結(jié)合效率，本研究將純化的BJ01-RBD、WIVI-RBD、RP3-RBD蛋白分別孵育瞬時(shí)表達(dá)人、果子貍、蝙蝠、小鼠ACE2及其突變體L440P的HeLa細(xì)胞，同時(shí)以已知的不結(jié)合ACE2的SL-CoV Rp3株的RBD為陰性對(duì)照。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示，相比于不同物種ACE2與BJ01以及WIV1的RBD區(qū)的結(jié)合效率，ACE2-L440P突變后結(jié)合能力明顯減弱，這與假病毒試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步證實(shí)了L440P位點(diǎn)是結(jié)合SARS-CoV BJ01以及SL-CoV WIV1的RBD區(qū)關(guān)鍵氨基酸突變位點(diǎn)(圖5)。

圖4 RBD蛋白的表達(dá)及純化Fig.4 Expression and purification of RBD proteins(a)Western-blot檢測(cè)細(xì)胞上清中的RBD蛋白；(b)Western-blot驗(yàn)證純化的RBD蛋白；(c)SDS-PAGE檢測(cè)純化的RBD蛋白(a)Detection of the expression of RBD proteins in supernatant by western-blot;(b)Detection of the purified RBD proteins by western-blot;(c)Detection of the purified RBD proteins by SDS-PAGE

圖5 RBD與ACE2及其突變體結(jié)合效率的測(cè)定Fig.5 Determination of the binding efficiency of RBD to ACE2 and its mutants(a)SARS-CoV BJ01 RBD蛋白與ACE2及其突變體L440P結(jié)合效率測(cè)定；(b)SL-CoV WIVI RBD蛋白與ACE2及其突變體L440P結(jié)合效率測(cè)定；(c)SL-CoV RP3 RBD蛋白與ACE2及其突變體L440P結(jié)合效率測(cè)定，作為陰性對(duì)照(a)Determination of the binding efficiency of SARS-CoV BJ01 RBD with ACE2 and mutation L440P;(b)Determination of the binding efficiency of SL-CoV WIVI RBD with ACE2 and mutation L440P;(c)Determination of the binding efficiency of SL-CoV RP3 RBD with ACE2 and mutation L440P, negative control

3 討論

蝙蝠為群居動(dòng)物，有獨(dú)特的生物學(xué)和免疫學(xué)特征，攜帶多種病毒[17]。蝙蝠被認(rèn)為是多種新發(fā)病毒的自然宿主，如非洲爆發(fā)的埃博拉病毒(Ebola virus)和馬爾堡病毒(Marburg virus)、澳大利亞的亨德拉病毒(Hendra virus)、東南亞的尼帕病毒(Nipah virus)、中東的呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、以及起源于我國(guó)的SARS-CoV等[17,18]。蝙蝠攜帶多種SL-CoV，特別是菊頭蝠屬(Rhinolophus)的中華菊頭蝠(Rhinolophussinicus)[19,20]。其中SL-CoV WIVI和WIV16與SARS-CoV具有相同的結(jié)構(gòu)和高度相似的序列，且能利用ACE2作為其功能受體，證實(shí)了蝙蝠是SARS-CoV的自然宿主[6,21]。目前，SARS-CoV和SL-CoV已被歸類為Sarbecovirus亞屬，β-冠狀病毒屬，冠狀病毒亞科，冠狀病毒科[20]。自然界中，冠狀病毒s基因突變率高、變異快，不同株系間s基因重組事件的頻繁發(fā)生，導(dǎo)致新型毒株的出現(xiàn)和流行，從而增加了感染到人類或其他哺乳動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)[22,23]。2017年，豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus，SADS)起源于菊頭蝠冠狀病毒HKU2(Rhinolophus bat coronavirus HKU2)，在其s基因N端結(jié)構(gòu)域的第75位，一個(gè)氨基酸的插入可能造成了蝙蝠到豬的跨物種傳播[24]。長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)蝙蝠來源冠狀病毒的演變，對(duì)于預(yù)防人類疾病和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

嚙齒動(dòng)物在自然界中廣泛分布，是重要的動(dòng)物病原貯存庫(kù)[25]。鼠類與人類的活動(dòng)有著密切的聯(lián)系，可以通過尿液、糞便以及身上攜帶的節(jié)肢動(dòng)物如跳蚤、虱子、螨蟲等使病毒與人類直接接觸，為病毒的跨物種傳播提供了機(jī)會(huì)[26,27]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，鼠類攜帶多種冠狀病毒，如鼠科冠狀病毒鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)和大鼠涎淚腺炎冠狀病毒(rat sialodacryoadenitis coronavirus，RCoV)；云南大鼠體內(nèi)的冠狀病毒株AcCoV-JC34；褐家鼠的新型Alpha屬冠狀病毒(Lucheng Rn rat coronavirus，LRNV)；羅賽鼠、黃胸鼠和社鼠中的鼠科冠狀病毒的新種(Longquan R1 rat coronavirus，LRLV)；黑線姬鼠、褐家鼠和羅賽鼠中的Betacoronavirus 1的新種(Longquan Aa mouse coronavirus，LAMV)，這都表明了嚙齒動(dòng)物也是冠狀病毒的重要宿主[28-30]。

研究表明，SARS-CoV宿主范圍廣泛，結(jié)構(gòu)模型顯示ACE2上18個(gè)氨基酸殘基與S蛋白直接接觸，而ACE2的353位點(diǎn)對(duì)于結(jié)合s基因487位點(diǎn)至關(guān)重要。人、果子貍和蝙蝠ACE2的353位點(diǎn)是賴氨酸，而小鼠則是組氨酸，使得353位殘基附近缺少一個(gè)疏水性口袋，最終導(dǎo)致了SARS-CoV入侵效率低下。這些氨基酸殘基的變化會(huì)直接影響SARS-CoV入侵細(xì)胞的效率[31]。本研究通過構(gòu)建不同ACE2的突變體探究其SARS-CoV和SL-CoV侵入細(xì)胞的重要位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)盡管ACE2-L440H和L440A的突變體在細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低，但是其對(duì)SARS-CoV和SL-CoV假病毒入侵效率基本沒有影響。我們猜測(cè)引入的ACE2-L440H和L440A突變可能會(huì)對(duì)蛋白的合成產(chǎn)生影響。ACE2-L440P突變體表達(dá)量變化不明顯，但是卻嚴(yán)重降低了假病毒入侵效率，由此猜測(cè)，導(dǎo)致RBD與ACE2結(jié)合受影響可能與氨基酸的性質(zhì)有關(guān)，如氨基酸殘基的大小和極性。亮氨酸與脯氨酸均屬于非極性氨基酸，但是脯氨酸側(cè)鏈?zhǔn)且粋€(gè)亞氨基結(jié)構(gòu)，體積較大，可能帶來較大的空間位阻效應(yīng)，從而影響ACE2與S的結(jié)合，進(jìn)而影響病毒入侵。本研究首次揭示了蝙蝠SL-CoV WIV1可以高效利用小鼠ACE2，其入侵效率與人類和果子貍ACE2一樣，并且利用效率高于蝙蝠ACE2。這表明小鼠ACE2是SL-CoV WIV1的功能受體。不同物種ACE2-L440P突變體顯著性降低與RBD區(qū)的結(jié)合效率，證實(shí)了ACE2的440位點(diǎn)是影響受體結(jié)合的新的重要氨基酸位點(diǎn)。本研究結(jié)果提示,自然界中的嚙齒動(dòng)物可以作為SL-CoV的潛在宿主，可能增加此類病毒跨物種傳播的風(fēng)險(xiǎn)，加強(qiáng)此類病毒在自然界的流行狀況的調(diào)查和研究，有助于預(yù)防相關(guān)病毒性疾病。