(揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

五甲川菁染料（Cy5）是菁染料中一類能夠增強(qiáng)感光材料感光性的重要熒光染料，摩爾消光系數(shù)較大，其吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)一般在650nm～750nm，屬于可見(jiàn)光至近紅外范圍內(nèi)，因此其屬于近紅外染料。同時(shí)在基因診斷（DNA 診斷或分子診斷）、蛋白質(zhì)標(biāo)記（基因的表達(dá)）、臨床診斷（離子和中性小分子的識(shí)別、細(xì)胞、組織以及活體成像）等方面廣泛應(yīng)用。

Waggoner 等[1]合成了N-羧基-5-磺酸鹽-3H-吲哚菁染料Cy3 和Cy5，染料分子中的羧基與生物大分子中的氨基共價(jià)結(jié)合，形成新的化學(xué)鍵，因此具有良好的熒光性和水溶性，已成為生物芯片上新一代先進(jìn)的商業(yè)化熒光探針。鄭洪等[2]用自合成法合成水溶性近紅外試劑七甲基花菁作為顯色探針，標(biāo)識(shí)出近紅外區(qū)的血清蛋白質(zhì)。Mccorquodale 等[3]證實(shí)ICG（吲哚菁綠）可用于檢測(cè)人體血清蛋白及其他蛋白質(zhì)，通過(guò)二極管誘發(fā)激光毛細(xì)管電泳熒光（CEIF）進(jìn)行表征。研究表明：合成的ICG（吲哚菁綠）具有長(zhǎng)吸收波長(zhǎng)、強(qiáng)熒光特性的優(yōu)點(diǎn)，因此在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中也得到了廣泛的應(yīng)用。Sowell 等[4]使用水溶性吲哚菁染料作為人血清蛋白的示蹤劑和非共價(jià)標(biāo)記物，用毛細(xì)管電泳法測(cè)定不同藥物對(duì)人血清蛋白結(jié)合能力的強(qiáng)弱。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)吲哚菁染料最佳的緩沖溶液是pH 值為9.0 的硼酸鹽，同時(shí)對(duì)布洛芬、奎納定、萘普生、丙咪嗪等藥物進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明：藥物與人體血清蛋白的結(jié)合對(duì)藥物的毒性、活性和人體排泄有一定的影響。

目前，菁染料還有著一些問(wèn)題：水溶性差、分離提純困難、耐光耐熱性差等，嚴(yán)重影響了菁染料的應(yīng)用，針對(duì)這些問(wèn)題，主要解決辦法有兩種，一是研發(fā)出有著更長(zhǎng)的吸收波長(zhǎng)的新型功能菁染料；二是通過(guò)改變菁染料的分子結(jié)構(gòu)，來(lái)增強(qiáng)它的穩(wěn)定性，從而拓寬其應(yīng)用范圍。

本文主要是在3-丙烯醛縮苯胺兩端加入中間體1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉和1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀。采用薄層色譜法點(diǎn)樣、展開(kāi)后，根據(jù)比移值（Rf）與合適的對(duì)照物按相同方法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對(duì)比之后，確定需要的菁染料組成，研究菁染料的性能變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉、1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀、3-丙烯醛縮苯胺（分析純，湖北巨勝科技）；N，N 二甲基甲酰胺（DMF）（分析純，南京仁恒化工）；二甲基亞砜（DMSO）(分析純，南京蘇研化工科技)；四氫呋喃、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮（分析純，常州中奧化工）；乙腈、氯仿（分析純，宜興市邁克化工）；乙酸酐、冰乙酸（分析純，蘇州玖佳化工）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

集熱式恒溫磁力攪拌器DF-101S，電子天平FA/JA（鞏義市英峪予華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-201D（上海民橋精密儀器有限公司分析儀器廠）；雙五金電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-1E（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；真空干燥箱TP-620A（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2550、熒光光譜儀RF5000（日本島津公司）；液質(zhì)聯(lián)用色譜儀HP1100LC-MCSD（安捷倫公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的合成

用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的染料中間體1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸鉀和縮合劑3-丙烯醛縮苯胺作為原料，在一定反應(yīng)條件下發(fā)生縮合反應(yīng)，得到相應(yīng)的對(duì)稱性五甲川菁染料Cy5，結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的基本結(jié)構(gòu)及合成路線Fig.1 Basic structure and synthetic route of 5-sulfonic acid N-ethyl Cy5 cyanine dye

溶劑為冰乙酸，催化劑為乙酸酐，反應(yīng)溫度為110℃，反應(yīng)時(shí)間4h，反應(yīng)過(guò)程中N2保護(hù)。取50mL 小燒瓶，將冰乙酸和乙酸酐以1：1 配比加入，即加入13mL 的冰乙酸和13ml 的乙酸酐，即再將摩爾比為2（中間體）：1.1（縮合劑）即187.4mg 的中間體和200mg 的縮合劑加入小燒瓶，再放入磁性轉(zhuǎn)子，置于加熱爐上加熱，加熱時(shí)不斷攪拌，加熱溫度到達(dá)110℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間4h。反應(yīng)結(jié)束后，將小燒瓶取下靜置冷卻到室溫，將其中剩余液體采用旋干蒸餾的方式的旋干，剩余固體樣品用二氯甲烷溶解后保存，用柱色譜法進(jìn)行分離提純。

1.3.2 N-乙基Cy5 菁染料的合成

用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的染料中間體1-間羧芐基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉和縮合劑3-丙烯醛縮苯胺作為原料，合成后的結(jié)構(gòu)如圖2 所示。

圖2 N-乙基Cy5 菁染料的基本結(jié)構(gòu)及合成路線Fig.2 Basic structure and synthetic route of N-ethyl Cy5 cyanine dye

取50mL 小燒瓶，將冰乙酸和乙酸酐以1（冰乙酸）：1（乙酸酐）配比加入，即加入13mL 的冰乙酸和13mL的乙酸酐，再將摩爾比為2（中間體）：1.1（縮合劑）即249.5mg 的中間體和200mg 的縮合劑加入小燒瓶，再放入磁性轉(zhuǎn)子，置于加熱爐上加熱，加熱時(shí)不斷攪拌，加熱溫度到達(dá)110℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間4h。反應(yīng)結(jié)束后，將小燒瓶取下靜置冷卻到室溫，將其中剩余液體采用旋干蒸餾的方式的旋干，剩余固體樣品用二氯甲烷溶解后保存，用柱色譜法進(jìn)行分離提純。

1.4 表征方法

1.4.1 菁染料的分離方法

采取薄層色譜制板和展開(kāi)，柱層析制作和分離，在色譜柱中不斷加入洗脫劑，樣品逐漸向下分離，收集流出液，用甲醇萃取，萃取后的染料甲醇溶液采用旋干蒸餾的方法旋干，最后留下的固體即較純凈的菁染料。

1.4.2 質(zhì)譜及光學(xué)性能檢測(cè)

用液質(zhì)聯(lián)用色譜儀及核磁共振來(lái)表征化合物結(jié)構(gòu)，同時(shí)在紫外分光光度計(jì)上設(shè)定掃描光譜范圍是370nm～900nm，波長(zhǎng)間隔為1nm，時(shí)間間隔為1s，測(cè)定染料在不同有機(jī)溶劑下的的紫外可見(jiàn)吸收光譜。

1.4.3 滴定實(shí)驗(yàn)

選用在無(wú)磺酸基的菁染料乙腈溶液中對(duì)Cu2+離子的滴定，以得出Cu2+離子使菁染料在乙腈溶液中可以識(shí)別時(shí)的最佳濃度。在小瓶中配置1×10-5mol/L 的菁染料乙腈溶液，測(cè)紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)，作為空白對(duì)比數(shù)據(jù)，使用量程為0.5μL～2.5μL 的移液槍。在溶液內(nèi)濃度梯度為0.3 當(dāng)量地加入1×10-2mol/L 的Cu2+離子，觀察其紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)的變化，記錄并處理數(shù)據(jù)。

1.4.4 菁染料試紙制作

配置浸泡液，裁剪試紙，取出試紙，晾干并選取顏色分布均勻的紙條，將其裁剪成規(guī)格為1cm×1cm 的紙片，將紙片均勻放在玻璃板上，分別滴加一定量的金屬離子溶液，溶液要求完全浸濕紙片即可，等被金屬離子溶液浸濕的紙片晾干后，滴加乙腈，使乙腈將紙片完全浸濕，靜置晾干觀察是否有顏色變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 菁染料的質(zhì)譜分析

分離純凈后5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的收率為36 %。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ:8.29 (t，1H，J=11.0 Hz，CH=CH),7.76 (s，2H，Ar-H)，7.65 (d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H)，7.35 (d，2H，J=4.4Hz，Ar-H)，6.64(d，2H，J=12.0 Hz，CH=CH)，4.25～4.35 (m，4H，N-CHZ)，1.67 (s，12H,C(CH3)Z)。HRMS (TOF MS ES)calculated for C29H33N2K2(SO3)2H NMR 譜圖如圖3 所示。

圖3 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料1H NMR 譜圖Fig.3 1H-NMR spectrum of 5-sulfonic acid N-ethyl Cy5 cyanine dye

分離純凈后N-乙基Cy5 菁染料的收率為28.3 %。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)，δ:8.28 (t，1H，J=11.0 Hz，CH=CH),7.76 (s,2H，Ar-H)，7.64 (d，2H，J=8.0 Hz，Ar-H)，7.36 (d，2H，J=4.4Hz，Ar-H)，6.65～6.62 (d，2H，J=12.0 Hz，CH=CH)，4.20～4.35 (m，4H，N-CHZ)，1.67 (s，12H,C(CH3)Z).HRMS (TOF MS ES)calculated for C29H33N2H NMR 譜圖如圖4 所示。

圖4 N-乙基Cy5 菁染料1H NMR 譜圖Fig.4 1H-NMR spectrum of N-ethyl Cy5 cyanine dye

2.2 兩種菁染料的紫外-可見(jiàn)光譜分析

一共選取了實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的14 種有機(jī)溶劑，分別檢測(cè)了合成的兩種菁染料在14 種有機(jī)溶劑中的溶解性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種菁染料溶解性檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Test results of two cyanine dyes

在篩選出的溶解性較好的有機(jī)溶劑中進(jìn)行了金屬離子檢測(cè)，檢測(cè)的金屬離子有：Ca2+、K+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Cr2+、Cu+、Al3+、Fe2+、Na+、Mg2+、Ag+、Zn2+、Hg2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Ni2+、Sn2+、Sn4+、Ce3+、Co2+、Cd2+和乙醇（防止乙醇清洗比色皿時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，作為對(duì)比數(shù)據(jù)）。

5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈、乙醇、水、甲醇、DMSO、DMF 和丙酮七種有機(jī)溶劑中溶解性較好，紫外-可見(jiàn)光譜譜圖如圖5 所示。N-乙基Cy5 菁染料在乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMSO、DMF 和丙酮九種有機(jī)溶劑中溶解性較好，紫外光譜譜圖如圖6 所示。

圖5 5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料的紫外-可見(jiàn)光譜譜圖Fig.5 UV-visible spectrum of 5-sulfonic N-ethyl Cy5 cyanine dye.

圖6 N-乙基Cy5 菁染料的紫外-可見(jiàn)光譜譜圖Fig.6 UV-visible spectrum of N-ethyl Cy5 cyanine dye

由圖5、圖6 可以看出，5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在七種有機(jī)溶劑中的紫外-可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)分別為：640nm、641nm、635nm、634nm、646nm、645nm 和643nm；N-乙基Cy5 菁染料在九種有機(jī)溶劑中的紫外吸收波長(zhǎng)分別為：640nm、636nm、640nm、641nm、642nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

由圖7、圖8 可知，5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中，由多個(gè)金屬離子發(fā)生了熒光淬滅，同時(shí)紫外可見(jiàn)吸收譜圖中由一個(gè)峰變成了兩個(gè)峰。這是因?yàn)樵谝译嫒芤褐校既玖弦话銥閱尉垠w的形式存在，當(dāng)加入金屬離子后，單聚體變成了二聚體甚至是多聚體，從而導(dǎo)致譜圖的變化及菁染料乙腈溶液的顏色變化。但是加入金屬離子后菁染料本身沒(méi)有發(fā)生變化，只是物質(zhì)聚集狀態(tài)發(fā)生了變化，并且有多個(gè)金屬離子使它發(fā)生了變化，所以無(wú)法證明磺酸基菁染料對(duì)哪個(gè)金屬離子有識(shí)別能力。

圖7 有磺酸基菁染料在乙腈中的紫外譜圖Fig.7 UV spectrum of sulfocyanine dye in acetonitrile

圖8 有磺酸基菁染料在乙腈中的熒光譜圖Fig.8 Fluorescence spectrum of sulfocyanine dye in acetonitrile

N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶劑中加入金屬離子的紫外可見(jiàn)和熒光光譜譜圖分別如圖9、圖10 所示。

圖9 無(wú)磺酸基菁染料在乙腈中的紫外譜圖Fig 9 UV spectrum of sulfonate-free cyanine dye in acetonitrile

圖10 無(wú)磺酸基菁染料在乙腈中的熒光譜圖Fig 10 Fluorescence spectrum of sulfonate-free cyanine dye in acetonitrile

由圖9、圖10 可知，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中，只有加入Cu2+離子后其光譜發(fā)生了變化，而加入其他金屬離子并未對(duì)菁染料有影響。經(jīng)觀察，在N-乙基Cy5 菁染料乙腈溶液內(nèi)滴加Cu2+離子后顏色褪去接近無(wú)色透明，由此可以證明，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液中對(duì)Cu2+離子有著特殊的識(shí)別能力。在篩選出有這種特殊識(shí)別能力之后，加做滴定實(shí)驗(yàn)，確定能使N-乙基Cy5菁染料褪色的Cu2+離子最大濃度。滴定結(jié)果如圖11 所示。

圖11 Cu2+離子滴定菁染料的紫外可見(jiàn)光譜譜圖Fig 11 UV-Vis spectrum of Cu2+ ion titration of cyanine dye

由圖11 可知，當(dāng)Cu2+離子濃度不斷增大時(shí)，紫外波峰不斷降低，其紫外吸收波長(zhǎng)也不斷減小，這是因?yàn)榈渭覥u2+離子之后，Cu2+離子對(duì)N-乙基Cy5 菁染料本身發(fā)生了反應(yīng)，不僅使紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)發(fā)生變化，同時(shí)也使溶液顏色褪色至無(wú)色。

通過(guò)濃度梯度滴加Cu2+離子直至新生成的波峰不再發(fā)生變化，記錄Cu2+離子的濃度為1×10-2mol/L，即在1×10-5mol/L 的N-乙基Cy5 菁染料乙腈溶液中，1×10-2mol/L 濃度的Cu2+離子可使溶液顏色褪至無(wú)色。

2.3 菁染料試紙的制作

按照步驟制作好的試紙，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 Cu2+離子滴加N-乙基Cy5 菁染料乙腈試紙F(tuán)ig.12 The test paper of Cu2+ ions with N-ethyl Cy5 cyanine dye acetonitrile

由圖12 可知，在選用試紙制作以后，并沒(méi)有出現(xiàn)顏色褪去的現(xiàn)象。這可能是因?yàn)楫?dāng)試紙被菁染料浸泡過(guò)后，菁染料附著在了試紙上，成為固定相，當(dāng)再次滴加離子的時(shí)候，離子已經(jīng)無(wú)法再對(duì)固定在試紙上的菁染料產(chǎn)生作用。在此基礎(chǔ)上又增加了一個(gè)溶液檢測(cè)Cu2+離子的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖13 所示。

圖13 N-乙基Cy5 基菁染料乙腈溶液滴加金屬離子顯色圖Fig.13 The appearance of N-ethyl Cy5 based cyanine dye in acetonitrile solution

由此可得，N-乙基Cy5 菁染料只有在乙腈溶液中才有對(duì)Cu2+離子的特殊識(shí)別能力，這是因?yàn)樵谝译嫒芤喝芤褐?，菁染料處于游離狀態(tài)，Cu2+離子可以與游離態(tài)的菁染料發(fā)生指示作用，進(jìn)而引起菁染料的褪色。

3 結(jié)論

菁染料(Cy)因在近紅外區(qū)域有較強(qiáng)的熒光發(fā)射且易于修飾，從而近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于敏化生物分子、細(xì)胞和組織等物質(zhì)，形成熒光標(biāo)記的復(fù)合體，從而為生物分析、生物成像和疾病(特別是腫瘤)的機(jī)理分析和治療提供了一條非常便利的途徑。

本實(shí)驗(yàn)研究分別合成了兩種Cy5 菁染料，分別是5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料和 N-乙基Cy5 菁染料，對(duì)它們產(chǎn)物進(jìn)行了分離提純，并測(cè)試了它們的光譜性能及離子檢測(cè)，結(jié)論如下：

（1）5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料在乙腈、乙醇、水、甲醇、DMSO、DMF、丙酮七種有機(jī)溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)分別為：640nm、641nm、635nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

（2）N-乙基Cy5 菁染料在乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMSO、DMF、丙酮九種有機(jī)溶劑中的紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)分別為：640nm、636nm、640nm、641nm、642nm、634nm、646nm、645nm、643nm。

（3）5-磺酸基N-乙基Cy5 菁染料對(duì)金屬離子的識(shí)別能力較差，達(dá)不到識(shí)別性能，而N-乙基Cy5 菁染料對(duì)金屬離子的識(shí)別能力較為特殊，只有在特定的溶劑中才對(duì)特定的離子有識(shí)別能力。

（4）N-乙基Cy5 菁染料相對(duì)較穩(wěn)定，在大多數(shù)有機(jī)溶劑中可溶，加入金屬離子后對(duì)其性質(zhì)無(wú)影響，N-乙基Cy5 菁染料在乙腈溶液內(nèi)，對(duì)Cu2+離子有一定的識(shí)別能力，但是在試紙上實(shí)驗(yàn)不行，只有游離態(tài)的菁染料對(duì)Cu2+離子有識(shí)別能力。