郭 霞，虞 杰，顧冬梅，楊紅麗

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215006）

隨著21世紀(jì)醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷進(jìn)步，病理學(xué)也隨之發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的分析手段和檢測(cè)方法，然而，免疫組化染色技術(shù)作為對(duì)腫瘤確診分型、明確來源、判斷預(yù)后等方面研究提供重要支持的技術(shù)手段，其作用仍然不可替代，意義重大[1]?？煽康娜旧Y(jié)果是準(zhǔn)確診斷的前提，伴隨各單位對(duì)免疫組化質(zhì)控的重視日漸提高，2015年國(guó)際特設(shè)專家委員會(huì)對(duì)18 種常用抗體的對(duì)照組織以及它們的染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)做出了推薦[2]。傳統(tǒng)的手工染色方法由于多方面的不足，已經(jīng)逐漸被各種自動(dòng)化染色系統(tǒng)所替代，全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)穩(wěn)定、精確 、高效，染色結(jié)果可靠性大大提高[3]，為后期診斷治療提供了良好的先決條件，但由于其工作原理設(shè)計(jì)等原因，也會(huì)出現(xiàn)染色結(jié)果不佳的現(xiàn)象，目前，針對(duì)我院使用的Ventana BenchMark XT和Dako omnis兩種全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)，對(duì)其各自的優(yōu)勢(shì)和不足之處進(jìn)行了總結(jié)和對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料 選取本院自2017年1月—2019年6月經(jīng)兩位經(jīng)驗(yàn)豐富高年資病理醫(yī)師專家確診的淋巴瘤、乳腺癌及胃腸道間質(zhì)瘤組織標(biāo)本各10 例進(jìn)行染色。

1.2 儀器

1.2.1 Ventana BenchMark XT染色系統(tǒng)：該系統(tǒng)可自動(dòng)進(jìn)行脫蠟，抗原修復(fù)，免疫組化染色，蘇木素復(fù)染及藍(lán)化，可針對(duì)不同抗體的個(gè)性化需求進(jìn)行獨(dú)立的染色程序設(shè)置，并具有在染色過程中對(duì)每個(gè)切片位置進(jìn)行獨(dú)立監(jiān)控及對(duì)錯(cuò)誤故障報(bào)警的功能[4]，其特有的LCS液體封蓋膜技術(shù)，對(duì)免疫組化染色過程中防止干片的濕盒起到了非常好的替代作用，該系統(tǒng)每次可同時(shí)進(jìn)行30 張切片的免疫組化染色，所有切片染色須全部完成才能取出，再進(jìn)行下一批切片染色。此外，由于不使用二甲苯，且專門針對(duì)廢液中DAB等毒性較強(qiáng)試劑進(jìn)行合理處置，因此其安全環(huán)保方面的優(yōu)勢(shì)也較為突出。

1.2.2 Dako omnis染色系統(tǒng)：該系統(tǒng)為密閉式全自動(dòng)染色處理環(huán)境，可自動(dòng)完成切片脫蠟-抗原修復(fù)-免疫組化染色-蘇木素復(fù)染-藍(lán)化的整個(gè)過程，采用加樣探針抽吸試劑滴加方式進(jìn)行染色，其染色混勻防干片系統(tǒng)采用Dynamic gap動(dòng)態(tài)蓋板液體混勻技術(shù)，染色過程中試劑可以18 ℃恒溫保存，系統(tǒng)還可對(duì)染色過程進(jìn)行全程監(jiān)控，對(duì)錯(cuò)誤故障以聲音和不同顏色報(bào)警燈進(jìn)行分類提示，為染色環(huán)境提供保障，該系統(tǒng)一次可分批或連續(xù)添加60 張切片進(jìn)行染色，并可在染色過程中一旦有染色程序耗時(shí)短先完成的切片空出染色位置后即可立即加入新的切片進(jìn)行染色，無需等待所有切片染色完成。其廢液系統(tǒng)可將無毒與有毒廢液分開單獨(dú)存放，大大減輕了有毒廢液處置壓力[5]。

1.3 試劑 本次實(shí)驗(yàn)試劑采用購(gòu)自DAKO公司的CD20，CD3和基因公司的CD117，ER，PR，GATA3共6 種一抗，以及Ventana BenchMark XT染色系統(tǒng)和Dako omnis染色系統(tǒng)各自配套的檢測(cè)和二抗顯色系統(tǒng)試劑。

1.4 方法 為評(píng)估不同染色系統(tǒng)對(duì)相同抗體及組織進(jìn)行染色時(shí)的影響，本實(shí)驗(yàn)將抗體與組織分為兩組，A組在Ventana BenchMark XT染色系統(tǒng)進(jìn)行染色，B組在Dako omnis染色系統(tǒng)上進(jìn)行染色，具體染色流程按照兩型染色系統(tǒng)相應(yīng)抗體的標(biāo)準(zhǔn)染色程序運(yùn)行處理。

2 結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)兩種染色系統(tǒng)均對(duì)每個(gè)抗體標(biāo)記物的染色流程分別進(jìn)行了獨(dú)立設(shè)定，除Ventana BenchMark XT染色系統(tǒng)一抗由手工滴加外，其余所有抗體及試劑的滴加均通過系統(tǒng)激光掃碼后自動(dòng)執(zhí)行，兩個(gè)系統(tǒng)的染色結(jié)果對(duì)比見表1和圖1。

表1 兩型全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)染色結(jié)果比較

圖1 兩型全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)不同指標(biāo)表達(dá)比較

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)中，兩種全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)均對(duì)染色環(huán)境控制穩(wěn)定，受外界因素影響很小，染色效率較高，染色結(jié)果較好，同型號(hào)染色系統(tǒng)同批次染色結(jié)果較為均一，但仍存在輕微差異。

對(duì)于免疫組化染色結(jié)果的影響因素有很多，在利用全自動(dòng)染色系統(tǒng)進(jìn)行染色前，組織前期固定，切片是否平整，切片的厚薄，刀痕，皺褶，抗體質(zhì)量等因素都會(huì)直接或間接對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生影響[6]。此外，不同染色系統(tǒng)由于其工作原理及自身特性，對(duì)染色結(jié)果的影響因素也各有不同[7]。

3.1 Ventana BenchMark XT染色系統(tǒng) 該系統(tǒng)使用了特有的LCS液體封蓋膜技術(shù)，在對(duì)反應(yīng)環(huán)境有所保證的同時(shí)也容易出現(xiàn)油膜下沉現(xiàn)象，導(dǎo)致全片組織無規(guī)則的部分或全部假陰性結(jié)果，在防止組織脫片的同時(shí)還需要防止油膜下沉，因此對(duì)載玻片的要求較高，需要使用親水型防脫載玻片。但優(yōu)勢(shì)是液體封蓋膜可以較好覆蓋全片范圍，因此在撈片時(shí)對(duì)組織在載玻片上的位置要求較低。

試劑保存溫度不當(dāng)易引起反應(yīng)效價(jià)降低，該系統(tǒng)的試劑臺(tái)是旋轉(zhuǎn)開放式的，在整個(gè)染色過程中試劑放置環(huán)境溫度與外界一致，因此使用該系統(tǒng)進(jìn)行染色時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的溫度要求較高。以25 ℃以下為宜，當(dāng)使用全自動(dòng)方案進(jìn)行染色時(shí)，每次配置一抗不宜過多，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)第一時(shí)間將試劑移至4℃冰箱進(jìn)行保存。

雖然本系統(tǒng)在新開試劑滴加前系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)按壓5 次以防瓶口空氣未排空，但部分情況下由于試劑瓶質(zhì)量不佳仍有可能造成染色時(shí)空滴導(dǎo)致染色假陰性，因此在上載新開封試劑前最好手工按壓試劑瓶，確認(rèn)滴加順暢，同時(shí)，本系統(tǒng)通過擊錘打壓試劑瓶滴加抗體到組織切片上，雖然對(duì)試劑瓶的識(shí)別通過激光掃描條碼完成，但在運(yùn)行前自檢時(shí)對(duì)試劑瓶位置細(xì)小偏差未必能夠發(fā)現(xiàn)，染色時(shí)會(huì)導(dǎo)致試劑滴偏出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此，上載試劑瓶時(shí)務(wù)必安裝到位無偏移再運(yùn)行程序。

3.2 Dako omnis染色系統(tǒng) 該系統(tǒng)使用Dynamic（動(dòng)態(tài)蓋板混勻技術(shù)），染色時(shí)由動(dòng)態(tài)蓋板保證染色玻片處于濕盒相同環(huán)境下避免干片，因此，組織切片只需使用普通防脫粘附載玻片即可，但蓋板區(qū)域外的組織易造成染色效果不佳，所以在撈片時(shí)需注意盡量將組織置于載玻片中心位置。

由于該系統(tǒng)的試劑存貯系統(tǒng)密閉且具有溫控功能，在整個(gè)染色過程中，試劑均處于18 ℃環(huán)境保存，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度要求相對(duì)寬松，對(duì)試劑保質(zhì)特別是維持一抗效價(jià)穩(wěn)定方面表現(xiàn)相對(duì)較好。但仍需注意避免一次配置過多導(dǎo)致時(shí)間過久試劑失效。

本系統(tǒng)通過探針抽吸滴加抗體及試劑到組織切片上，因此，當(dāng)試劑瓶?jī)?nèi)試劑不足，或有空泡時(shí)，易引起加樣探針空吸，加樣時(shí)空打，而且如加樣探針清潔不徹底，易引起交叉污染，有時(shí)因外力導(dǎo)致探針偏移位置不精準(zhǔn)，以上因素可能導(dǎo)致染色結(jié)果出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，非特異性背景及假陰性結(jié)果。

此外，本次實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于ER、PR、CD3這些指標(biāo)在兩種染色系統(tǒng)間染色結(jié)果無明顯差異外，也發(fā)現(xiàn)部分抗體在兩種染色系統(tǒng)間染色結(jié)果有一定程度的特定差異，如CD20，在Ventana BenchMark XT染色系統(tǒng)的染色結(jié)果中邊緣效應(yīng)及非特異性背景情況稍好一些；而CD117和GATA3這兩個(gè)指標(biāo)則在Dako omnis染色系統(tǒng)中染色敏感性更佳，染色結(jié)果更清晰，導(dǎo)致這些差異的原因可能是部分廠家個(gè)別克隆號(hào)抗體對(duì)不同染色系統(tǒng)的適應(yīng)性有所不同，主要考慮修復(fù)方式和二抗顯色系統(tǒng)對(duì)其親和力差異方面的原因[8]，也可能是因?yàn)閮尚腿旧到y(tǒng)的抗原修復(fù)方式和二抗顯色系統(tǒng)敏感性的區(qū)別，由于部分檢測(cè)系統(tǒng)其修復(fù)及二抗顯色系統(tǒng)具超敏性，可顯著放大增強(qiáng)抗原與抗體間的結(jié)合能力[9-10]，因此有更強(qiáng)的染色結(jié)果。對(duì)于這些現(xiàn)象，可以針對(duì)具體情況試著通過改變抗體濃度、使用增強(qiáng)型試劑盒及對(duì)應(yīng)染色方案、改用其他修復(fù)方式或者選用其他廠家及不同克隆號(hào)一抗等方式來解決問題。