聞甜 陳祥龍 武曉剛 權(quán)永剛 徐鵬 郭琪 倪萬潮 陳愛民

摘要：DnaJ蛋白不僅在生物體應(yīng)對熱激脅迫方面起作用，而且能響應(yīng)鹽、重金屬和氧化等多種脅迫，因此，DnaJ蛋白的相關(guān)研究對植物抗逆研究具有重要意義。在前期的研究中，筆者所在課題組已經(jīng)利用電子克隆及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）的方法從番茄中克隆了全長為465 bp的熱激蛋白基因LeDnaJ。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其功能，針對LeDnaJ基因構(gòu)建了含有35S啟動子及NOS終止子的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）品系R15中。目的基因的PCR檢測結(jié)果表明，LeDnaJ基因已經(jīng)整合到陸地棉R15基因組中;耐鹽性鑒定結(jié)果表明，LeDnaJ基因的表達(dá)，提高了陸地棉R15萌發(fā)期、苗期的耐鹽性。該研究結(jié)果為棉花耐鹽性的改良提供了新的基因資源。

關(guān)鍵詞：陸地棉;LeDnaJ基因;過表達(dá);耐鹽性

中圖分類號：S332.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0271-06

Abstract：DnaJ protein not only plays a role in the response of organisms to heat shock stress， but also responds to various stresses such as salt， heavy metals and oxidation， so the related researches are of great significance to stress resistance investigations in plants. The heat shock protein gene LeDnaJ with a whole length of 465 bp was cloned from tomato by the methods of electronic cloning and reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） in the previous studies. In order to verify the functions of LeDnaJ gene， the plant expression vector containing LeDnaJ gene with NOS terminator and 35S promoter was constructed and transformed into Gossypium hirsutum Linn. R15 by Agrobacterium-mediated method. The PCR detection result of the target gene showed that the LeDnaJ gene had been integrated into the cotton genome. The results of salt tolerance identification indicated that the expression of LeDnaJ gene improved the salt tolerance of Gossypium hirsutum Linn. R15 ?at germination and seedling stages. These results provide new genetic resources for the improvement of salt tolerance in cotton.

Key words：Gossypium hirsutum Linn.;LeDnaJ gene;overexpression;salt tolerance

DnaJ蛋白是首次從大腸桿菌中分離出來的一種41 000大小的熱激蛋白（Heat shock protein， HSP），又名HSP40[1]。熱激蛋白是植物為了適應(yīng)不斷變化的逆境脅迫而誘導(dǎo)自身產(chǎn)生的一種具有抵御作用蛋白質(zhì)。作為HSP70蛋白的輔助伴侶蛋白，DnaJ蛋白由腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）為HSP70蛋白供能，并引導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確組裝和折疊。HSP70蛋白本身并不直接參與新生多肽底物的結(jié)合，其功能的行使必須依賴能與其特異性結(jié)合的DnaJ蛋白。DnaJ蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在通常情況下含有3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別是位于N端的核心結(jié)構(gòu)為組氨酸/脯氨酸/天冬氨酸三肽的J結(jié)構(gòu)域、富含甘氨酸（G）和苯丙氨酸（F）的G/F結(jié)構(gòu)域和含有4個(gè)Cys-X-X-Cys-X-Gly-X-Gly（Cys為半胱氨酸，Gly為甘氨酸，X為任意氨基酸）基序的鋅指結(jié)構(gòu)域[2]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的種類，DnaJ蛋白家族成員可以分為以下3類：第1類，同時(shí)含有J結(jié)構(gòu)域、G/F結(jié)構(gòu)域及鋅指結(jié)構(gòu)域;第2類，含有J結(jié)構(gòu)域及G/F結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)域中的1個(gè);第3類，只含有J結(jié)構(gòu)域[3]。以上3類蛋白家族成員都具有與HSP70蛋白直接作用的J結(jié)構(gòu)域。

DnaJ蛋白在響應(yīng)許多生物及非生物脅迫的過程中起著重要作用。植物中的DnaJ可以響應(yīng)很多誘導(dǎo)因素，如重金屬、高溫、冷害、干旱、鹽堿及病原菌等。另外，DnaJ蛋白基因的表達(dá)有組織特異性，并受生物發(fā)育階段的調(diào)節(jié)。盡管目前人們已經(jīng)從擬南芥[4]、報(bào)春花[5]、苜蓿[6]等植物中獲得了DnaJ蛋白，但是關(guān)于植物中DnaJ蛋白的研究仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于人類、動物及細(xì)菌中DnaJ蛋白的相關(guān)研究。在前期的研究中，筆者電子克隆了番茄LeDnaJ基因的全長。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其功能，筆者構(gòu)建了含有35S啟動子及NOS終止子的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LeDnaJ基因轉(zhuǎn)化到陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）品系R15中，經(jīng)過目的基因的PCR檢測，獲得陽性轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花株系，進(jìn)一步分析該基因在鹽脅迫下的功能，從而為棉花耐鹽性的改良提供新的基因資源。

1材料與方法

1.1材料與試劑

本研究的供試番茄材料為Moneymaker，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供;轉(zhuǎn)基因棉花受體材料為陸地棉R15，是由晉棉7號多代再生選育出的胚胎發(fā)生純合系，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。采用天根生化科技（北京）有限公司的試劑盒提取番茄總RNA，再用DNA酶去除其中的gDNA，然后用M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2植物表達(dá)載體的構(gòu)建

在LeDnaJ基因的上、下游設(shè)計(jì)1對帶有BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ 酶切位點(diǎn)的特異引物（LeDnaJ-F-BamH Ⅰ：5′-CGGGATCCATGGCTTCTTCTTCTTTTCTTCTCTC-3′;LeDnaJ-R-Kpn Ⅰ：5′-GGGGTACCCTACCAACACTGATCGGTTTCCCATC-3′，引物中的下劃線表示酶切位點(diǎn)），將逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）產(chǎn)物連接到經(jīng)BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ 雙酶切處理的pCAMBIA2301載體上，構(gòu)建pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ植物表達(dá)載體。用熱激法將PCR和酶切鑒定驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，獲得工程農(nóng)桿菌EHA105用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株的鑒定

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法[7]將pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ轉(zhuǎn)化到受體棉花R15中。用特異性引物L(fēng)eDnaJ-F和LeDnaJ-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以篩選陽性植株。進(jìn)一步提取PCR檢測結(jié)果呈陽性植株的RNA，以反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，以LeDnaJ-RT-F（5′-CTCTACAATCGCCTCACATACA-3′）、LeDnaJ-RT-R（5′-TTCCCATCCTCGGCGAACAGTA-3′）為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分析目的基因的表達(dá)水平。

1.4萌發(fā)期和苗期棉花耐鹽性表型的鑒定

先用體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2對棉花種子消毒2～3 h，再用ddH2O清洗3～5次。萌發(fā)期發(fā)芽率的測定方法：將棉花種子置于含有200 mmol/L NaCl的玻璃培養(yǎng)皿中，重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)設(shè)50粒種子，以蒸餾水處理作為空白對照（CK），將玻璃培養(yǎng)皿置于溫度為（30±1） ℃、相對濕度為80%±2%的無光照環(huán)境中進(jìn)行催芽，以種子露白部分超過5 mm視為種子發(fā)芽，7 d后統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽數(shù)量。計(jì)算公式：種子萌發(fā)率=露白部分超過5 mm的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。萌發(fā)期根長的測定：將棉花種子置于含有200 mmol/L NaCl的固體MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)材料設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)50粒種子，種子發(fā)芽（露白部分>5 mm）后，測量種子的根系長度（cm）。

將預(yù)先發(fā)芽的轉(zhuǎn)基因株系及其對照R15種子播于一次性紙杯中，置于溫度為28 ℃、光照時(shí)間為16 h/d的房間內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待植株長至2葉1心期時(shí)開始進(jìn)行鹽處理，分別用350 mmol/L NaCl和清水各處理10株幼苗，同時(shí)，另取生長一致的10株幼苗，測量處理前植株的株高、地上部鮮質(zhì)量和地上部干質(zhì)量等。處理30 d后分別測定350 mmol/L NaCl和清水處理植株的株高、地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量等。分別計(jì)算鹽脅迫、清水處理植株培養(yǎng)30 d的生長量，以植株在清水中的生長量作為對照，計(jì)算植株在鹽脅迫下的相對生長量，評價(jià)其耐鹽性。

1.5數(shù)據(jù)分析方法

用t檢驗(yàn)測試組間平均值的差異，分析轉(zhuǎn)基因材料與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g的表型是否存在差異。

2結(jié)果與分析

2.1LeDnaJ基因序列分析

在前期的研究中，筆者電子克隆了番茄的LeDnaJ基因，該基因序列全長465 bp，GenBank登錄號為EF208898.1。利用DNAStar等軟件分析得出，該基因編碼的蛋白質(zhì)含有155個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為17 030，理論等電點(diǎn)為10.49。通過美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.Cgi）對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，LeDnaJ基因編碼的蛋白質(zhì)僅在N端含有1個(gè)高度保守的長約70個(gè)氨基酸的J-結(jié)構(gòu)域，屬于僅含有1個(gè)J結(jié)構(gòu)域的第3類DnaJ-like蛋白家族成員。

2.2轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花的鑒定結(jié)果

分別用KpnⅠ、BamHⅠ對LeDnaJ目的片段和載體質(zhì)粒pCAMBIA2301-CaMV35S進(jìn)行雙酶切，然后連接、轉(zhuǎn)化，用引物L(fēng)eDnaJ-F、LeDnaJ-R對轉(zhuǎn)化后得到的重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到465 bp大小的片段，與預(yù)期大小一致。經(jīng)酶切鑒定及測序驗(yàn)證正確后，篩選出構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ轉(zhuǎn)化到受體棉花材料R15中，經(jīng)過植物組織培養(yǎng)，得到T0代植株。將T0代轉(zhuǎn)基因種子通過種植進(jìn)行加代，提取T1代植株葉片的DNA，并進(jìn)行PCR檢測，獲得8株pCAMBIA2301-CaMV35S-LeDnaJ陽性單株（圖1）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LeDnaJ基因整合到陸地棉基因組中后的表達(dá)情況，筆者從獲得的8株陽性單株中選擇3株提取RNA并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。如圖2所示，RT-PCR鑒定結(jié)果驗(yàn)證了3株陽性單株中的LeDnaJ基因均能夠正常表達(dá)。

2.3轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花株系萌發(fā)期的耐鹽性

在前期進(jìn)行同源比對后發(fā)現(xiàn)，LeDnaJ基因與AT2G17880基因同源，后者編碼DNA J protein C24。Sottosanto等研究發(fā)現(xiàn)，AT2G17880基因受到鹽脅迫的誘導(dǎo)[8]。因此，本研究從表型上對轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花株系后代在萌發(fā)期、苗期的耐鹽性進(jìn)行鑒定。經(jīng)過連續(xù)自交，獲得3個(gè)T5代轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花純系后代，分別挑選3個(gè)轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花株系、受體材料R15（對照）50粒飽滿的種子用于萌發(fā)期發(fā)芽率的測定。在第7 d統(tǒng)計(jì)棉花種子的發(fā)芽數(shù)量，從表1可以看出，鹽脅迫下3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系的相對發(fā)芽率均顯著高于對照，因此認(rèn)為，LeDnaJ基因的表達(dá)提高了棉花R15種子在鹽脅迫下的發(fā)芽率。

本研究同時(shí)測量了3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系及其受體材料R15（對照）在鹽脅迫下萌發(fā)期的根長。由圖3可見，在含有200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上催芽3 d后，對照的根系伸長受到了明顯抑制，而3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系的根系伸長相對正常，均明顯高于對照。將鹽脅迫下的棉花根長與清水處理的棉花根長的比值作為相對根長，由表2可知，D-1、D-2、D-3這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的相對根長均極顯著高于對照，說明LeDnaJ基因的表達(dá)提高了陸地棉R15萌發(fā)期的耐鹽性。

2.4轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花株系苗期的耐鹽性

待3個(gè)轉(zhuǎn)LeDnaJ基因棉花植株長至2葉1心期時(shí)，分別用350 mmol/L NaCl和清水處理植株，30 d后測定鹽脅迫、清水處理植株的相關(guān)表型指標(biāo)，從而鑒定轉(zhuǎn)基因棉花株系苗期的耐鹽性。由圖4可見，處理30 d后鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因棉花株系的株高明顯高于其受體材料R15（對照）。表3顯示，3個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系的相對株高、地上部分相對鮮質(zhì)量和地上部分相對干質(zhì)量均顯著或極顯著高于受體材料R15（對照），表明LeDnaJ基因的表達(dá)提高了陸地棉R15苗期的耐鹽性。

3討論

近期的研究發(fā)現(xiàn)，DnaJ蛋白作為一種廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶參與了多種植物抵抗非生物脅迫的過程。張大棟等[9]通過抑制消減雜交方法，從鹽生植物海蓬子中克隆了DnaJ-like基因，Northern雜交結(jié)果顯示，在200 mmol/L NaCl脅迫下，該基因的表達(dá)量顯著增多。趙志常等[10]通過RT-PCR技術(shù)從野生型擬南芥中克隆了DnaJ基因，并構(gòu)建了含有目的基因的pET32a原核表達(dá)載體，在細(xì)菌中過量表達(dá)DnaJ基因后發(fā)現(xiàn)，其在含有0.5 mol/L NaCl的培養(yǎng)基中仍然可以正常生長，推測DnaJ基因的過表達(dá)提高了細(xì)菌的耐鹽性。擬南芥中的BIL2基因是定位在線粒體上的DnaJ基因家族成員[11]，過表達(dá)BIL2基因能增強(qiáng)擬南芥植株對鹽和強(qiáng)光脅迫的耐受性[12]。Fu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ER-sHSP基因能夠提高番茄的耐鹽能力，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)ER-sHSP番茄植株通過更粗壯的根來維持其體內(nèi)相對較高的含水量，同時(shí)也能夠吸收少量的Na+，積累更多的滲透物質(zhì)和Ca2+，以減少鹽脅迫對光系統(tǒng)的傷害。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AsHSP17能夠被高溫、鹽脅迫或脫落酸（ABA）處理所誘導(dǎo)。過表達(dá)AsHSP17基因會提高匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）對外源脫落酸和鹽的超敏性，在這一過程中AsHSP17蛋白作為分子伴侶負(fù)調(diào)控光合作用和脫落酸依賴/獨(dú)立的信號通路，提高了匍匐剪股穎對不良環(huán)境的抗性。

本研究從番茄中克隆了熱激蛋白基因LeDnaJ，并通過轉(zhuǎn)基因棉花株系驗(yàn)證了其耐鹽功能，發(fā)現(xiàn)LeDnaJ基因顯著提高了陸地棉的耐鹽性。目前，關(guān)于陸地棉中已克隆的熱激蛋白基因的研究仍然較少。Kosmas等[15]從陸地棉中克隆了HSPCB基因，RT-PCR結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)。Maqbool等[16]從受干旱脅迫的亞洲棉中克隆了GHSP26基因，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫后的亞洲棉脫水葉片組織中GHSP26基因顯著表達(dá)，過量表達(dá)GHSP26基因提高了陸地棉對干旱和熱脅迫的耐受性[17-18]。此外，Wang等[19]應(yīng)用表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）組裝法和全基因組鑒定技術(shù)克隆了40個(gè)GhHsf基因，對植物不同發(fā)育階段、不同組織中基因表達(dá)譜的分析結(jié)果表明，GhHsfs基因在棉花響應(yīng)非生物脅迫耐受性和纖維發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。近年來，越來越多的非生物脅迫嚴(yán)重影響棉花的生長發(fā)育過程，導(dǎo)致其產(chǎn)量減少和纖維品質(zhì)下降。其中鹽害和干旱對于棉花產(chǎn)量潛力發(fā)揮的影響最嚴(yán)重。DnaJ蛋白家族成員作為脅迫響應(yīng)因子將在棉花抵御干旱和鹽害脅迫中扮演重要的角色，進(jìn)一步加強(qiáng)棉花DnaJ蛋白家族成員的研究將為棉花抗旱、抗鹽堿的遺傳改良提供更豐富的基因資源。

鑒于在響應(yīng)逆境脅迫過程中的保護(hù)性角色，DnaJ蛋白在多種作物中已經(jīng)受到廣泛的關(guān)注。通過分子遺傳學(xué)手段已經(jīng)證實(shí)了DnaJ蛋白在多種逆境脅迫下起調(diào)節(jié)作用，并且在多種植物中過表達(dá)DnaJ基因可以改良植物抵抗逆境脅迫的能力。植物在面臨逆境脅迫時(shí)，能夠激活并表達(dá)DnaJ蛋白，保護(hù)正常蛋白質(zhì)不被降解以維持植物自身正常的生長發(fā)育。然而，DnaJ蛋白如何抵抗逆境脅迫以發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制還未被解析。因此，進(jìn)一步加深DnaJ蛋白與其他蛋白質(zhì)之間互作的研究將有助于解析其抵抗逆境脅迫的分子機(jī)制，從而為植物的抗逆育種提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：徐艷）