唐紅霞 郝爽 張振國 黃俊嶺 邵鵬 羅璋 馮守明

摘要：2019年7月，天津市某南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）養(yǎng)殖池塘發(fā)生病害，其主要癥狀為體色微紅，空腸空胃，肝胰腺萎縮。為分析病因，通過寄生蟲和病毒檢測、病原菌分離鑒定和藥物敏感性測定等方法對患病南美白對蝦及病原進行了研究。結果表明：從患病南美白對蝦鰓絲中未發(fā)現(xiàn)大量寄生蟲;傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒檢測結果為陰性，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和肝腸胞蟲檢測結果為陽性;肝胰腺中存在大量細菌，對優(yōu)勢菌落進行純化并命名為DX-201901，根據(jù)生理生化特征和法國梅里埃細菌全自動鑒定系統(tǒng)將其鑒定為副溶血弧菌;菌株DX-201901對鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、硫酸鏈霉素和氟苯尼考等4種藥物較為敏感，選擇氟苯尼考為治療藥物，按25.0 mg/kg蝦體重進行拌料投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d，取得了較好的治療效果。

關鍵詞：南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）;副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）;藥物敏感性;治療

南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）因適應能力強、生長速度快、營養(yǎng)價值高等優(yōu)點而被廣泛養(yǎng)殖，是當今世界養(yǎng)殖產量最高的三大蝦類品種之一。然而，近年來南美白對蝦病害的頻頻發(fā)生已經嚴重阻礙了該產業(yè)的發(fā)展。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、歐文氏弧菌（Vibrio owensii）、坎貝氏弧菌（Vibrio campbellii）等細菌性病原[1-4];白斑病毒、桃拉病毒、偷死野田村病毒等病毒性病原[5-6];以及寄生蟲病原，例如肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei）等相繼被報道[7]。疾病已成為阻礙南美白對蝦產業(yè)發(fā)展的最主要因素之一[8]。與所有甲殼動物類似，對蝦沒有獲得性免疫系統(tǒng)，其防御病原感染的途徑主要依靠先天性免疫。因此，目前尚未有針對南美白對蝦的疫苗可以使用，這進一步增加了南美白對蝦對化學藥物的依賴性。

2019年7月中旬，天津市武清區(qū)某南美白對蝦養(yǎng)殖池塘發(fā)生疾病，為了盡快進行病因分析，以便采取合理措施控制疾病的蔓延，筆者對病原進行了分離，并對分離純化的疑似病原開展了藥物敏感性試驗，利用篩選的藥物進行治療，取得了較好的效果。

1材料與方法

1.1南美白對蝦的發(fā)病情況

在巡塘過程中，將設置在池塘中的移動料臺拎出水面進行觀察，發(fā)現(xiàn)有部分蝦存在異常，典型癥狀為蝦體和須微紅，空腸空胃，肝胰腺萎縮，活力差，隨機統(tǒng)計100尾蝦，具有患病癥狀蝦的比例為28%。

1.2病原菌的分離和寄生蟲觀察

用75%酒精棉球反復擦拭患病南美白對蝦體表后，在無菌操作臺中用接種環(huán)從蝦的肝胰腺取少量樣品劃線接種于營養(yǎng)瓊脂（LB）平板和硫檸膽蔗瓊脂（TCBS）平板，28 ℃培育24 h后，選優(yōu)勢菌落進行純化獲得純培養(yǎng)DX-201901。同時，取患病南美白對蝦的鰓絲、附肢和肝胰腺在顯微鏡下進行寄生蟲檢查。

1.3南美白對蝦病原的檢測

隨機取9尾具有典型癥狀的患病蝦，取肝胰腺混合后均分為二份，分別使用DNA和RNA提取試劑盒按照說明書提取DNA和RNA，并將RNA反轉為cDNA作為模板進行病原檢測。分別用PCR和套式PCR的方法對副溶血弧菌、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、肝腸胞蟲、虹彩病毒和偷死野田村病毒等6種病原進行檢測，引物序列見表1。PCR反應體系為：DNA或cDNA模板1.0 μL， 2×Mix 25 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），補齊雙蒸水至50 μL。PCR的反應條件為：94 ℃預變性5 min后進行如下循環(huán)，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4病原菌的鑒定

1.4.1形態(tài)學觀察將菌株DX-201901分別劃線接種于LB平板和TCBS平板，28 ℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察其菌落形態(tài)，并挑取少量菌苔進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察染色特性和菌體形態(tài)。

1.4.2全自動細菌鑒定儀鑒定利用梅里埃VITEK 2 Compact系統(tǒng)，按GN試劑卡片說明書操作。

1.5藥物敏感性測定

1.5.1待測細菌的準備將DX-201901菌株接種在LB培養(yǎng)液中，28 ℃ 150 r/min過夜培養(yǎng)后，6 000 g，10 min離心收集菌體，無菌0.75%生理鹽水洗滌一次后，將菌液濃度調整至1×107 CFU/mL，備用。

1.5.2供試藥物的選擇選擇硫酸新霉素、諾氟殺星、硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、硫酸慶大霉素、鹽酸四環(huán)素、氨芐青霉素、恩諾殺星、硫酸卡那霉素、氟苯尼考等10種藥物進行藥敏試驗。

1.5.3最小抑菌濃度（MIC）的測定參照陳昌福等[9]的方法進行。各種藥物用適宜介質溶解后，采用2倍稀釋法用0.75%無菌生理鹽水將各種藥物依次稀釋至1 000.0～0.25 μg/mL等13個濃度。然后再用LB培養(yǎng)液將各濃度的藥物稀釋10倍，最終，各種藥物的濃度為100.0～0.025 μg/mL等13種。將100.0 μL 1×107 CFU/mL的DX-201901菌液加入到含不同濃度藥物的LB培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察證實無菌生長的最低藥物濃度，即為該藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MIC）。

1.6藥物治療試驗

將氟苯尼考按25.0 mg/kg南美白對蝦體重的使用量，與粘合劑混勻后均勻拌在飼料中制備成藥物餌料進行投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d。

2結果

2.1病原菌的分離

取具典型癥狀的南美白對蝦肝胰腺劃線接種于LB和TCBS平板，都長出大量形態(tài)單一的菌落，從TCBS平板中取優(yōu)勢菌落進一步純化，分離得到細菌1株，命名為DX-201901。該菌株在LB平板上28 ℃培養(yǎng)24 h后，形成圓形、濕潤、光滑、邊緣整齊中間隆起的淡黃色菌落，在TCBS上形成形態(tài)類似的藍綠色菌落。

2.2病原菌的鑒定

通過革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)菌株DX-201901為革蘭陰性短桿菌，無芽胞，呈弧狀。利用法國梅里埃公司的全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定的結果為副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），可信度為96%，鑒定評語為極好的鑒定。具體生化反應見表2。

2.3南美白對蝦的病原檢測

利用顯微鏡，除在鰓絲中發(fā)現(xiàn)少數(shù)累枝蟲外，未觀察到其他寄生蟲。利用PCR方法對具有典型癥狀的南美白對蝦進行6種病原的檢測，結果顯示：副溶血弧菌和肝腸胞蟲為陽性，傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒為陰性（圖2）。

10種抗菌藥物對菌株DX-201901的MIC測定結果如表3所示。鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、硫酸鏈霉素和氟苯尼考具有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為3.12、1.56、 1.56和0.78 μg/mL， 其他各種藥物的最小抑菌濃度都≥12.5 μg/mL。

2.5野外治療效果

根據(jù)藥物敏感性試驗結果，采用最小抑菌濃度值較低的氟苯尼考對患病南美白對蝦進行治療，在投喂3 d后，料臺中具有典型癥狀的蝦數(shù)量下降，隨機統(tǒng)計100尾蝦，具有癥狀的南美白對蝦比例為12%，連續(xù)用藥5 d后，料臺中沒有發(fā)現(xiàn)具有典型癥狀的南美白對蝦，說明氟苯尼考對該疾病具有較好的治療效果。

3討論

據(jù)統(tǒng)計，2018年因病害給我國南美白對蝦養(yǎng)殖造成的直接經濟損失為117.8億元[10]。為了對疾病進行預防，通常使用微生態(tài)制劑、藻類、免疫增強劑等產品改善養(yǎng)殖水體環(huán)境和調節(jié)南美白對蝦的免疫能力，這些措施在南美白對蝦養(yǎng)殖中發(fā)揮了重要作用。然而，當疾病發(fā)生以后，這些措施往往效果不佳，疾病治療仍需以使用藥物為主。按照病原分類，南美白對蝦的疾病可分為寄生蟲性、病毒性和細菌性疾病。目前，南美白對蝦的寄生蟲性病原主要是纖毛蟲類和肝腸胞蟲，本試驗中通過顯微鏡觀察未發(fā)現(xiàn)大量的纖毛蟲，但檢測到肝腸孢蟲陽性。據(jù)報道，肝腸孢蟲主要是影響南美白對蝦生長，感染后表現(xiàn)為生長速度緩慢，不產生體色發(fā)紅空腸空胃等發(fā)病特征。根據(jù)前期的監(jiān)測結果，傳染性皮下及造血組織壞死病毒、白斑病毒、虹彩病毒和偷死野田村病毒等四種病毒是天津地區(qū)南美白對蝦的常見病毒性病原，但本試驗中檢測結果均為陰性，因此初步排除了寄生蟲和病毒性疾病的可能。檢測結果顯示副溶血弧菌陽性，且從南美白對蝦肝胰腺進行病原的分離，發(fā)現(xiàn)TCBS平板上生長出大量的藍綠色菌落，經鑒定為副溶血弧菌。這暗示著副溶血弧菌可能是引起此次病害的病原。根據(jù)柯赫氏法則，如果需要對分離的疑似病原進行確認，應該利用分離株對同類動物進行回歸感染試驗，該項操作通常需要7～15 d。南美白對蝦具有殘食的特點，發(fā)病個體由于行動遲緩容易被健康個體殘食，從而導致了病害傳播速度非常快，這對生產實際中如何快速判斷病原提出了更高的要求，所以本試驗沒開展回感試驗;但是，分離到的疑似病原經鑒定為副溶血弧菌，該菌是南美白對蝦的常見病原，引起南美白對蝦的急性肝胰腺壞死病，主要癥狀為肝胰腺萎縮，體色發(fā)紅[1]，與本次發(fā)病觀察到的癥狀一致。據(jù)此，我們判斷引起此次病害的病原為副溶血弧菌的可能性較大。

為了較好地選擇有效藥物對水產動物細菌性疾病進行治療，需要對病原菌進行藥物敏感性測定。較常見的測定方法有兩種，一種為紙片法，即將帶有一定濃度藥物的紙片粘貼于涂布了待測菌液的平板上，培養(yǎng)一定時間后通過測定抑菌圈的大小來判斷敏感程度，該方法操作方便、簡單，但通常用于定性試驗。另一種方法為本試驗中使用的最小抑菌濃度（MIC）法，該方法能準確計算出藥物對病原菌的MIC值，因此在生產實際中較為實用。實驗結果表明，鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、硫酸鏈霉素和氟苯尼考對菌株DX-201901有較好的抑菌效果，而硫酸新霉素、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素和諾氟沙星的抑菌效果比較差。我們選擇了抑菌效果較好的氟苯尼考對南美白對蝦進行治療，連續(xù)用藥5 d以后，料臺中已經找不到具有典型癥狀的南美白對蝦，說明氟苯尼考對該疾病具有較好的治療效果。

南美白對蝦由于養(yǎng)殖利潤高而受到養(yǎng)殖者的青睞，據(jù)統(tǒng)計，天津市50%以上的池塘都在開展南美白對蝦養(yǎng)殖，但病害的發(fā)生也非常普遍，很多養(yǎng)殖者也因此失去信心。而本試驗的研究表明，在準確判斷病原后，篩選合適的藥物進行治療，能起到較好的效果。此外，由于南美白對蝦病害不易被發(fā)現(xiàn)，且傳播速度快，因此養(yǎng)殖過程中一定要細觀察，多巡塘，爭取早發(fā)現(xiàn)早治療，減少經濟損失。

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（收稿日期：2020-02-20）

基金項目：天津市水產研究所創(chuàng)新團隊項目（scyjs201904）;天津市科技計劃項目（18ZXBFNC00040）;天津市水產產業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目（ITTFR 201708）。

作者簡介：唐紅霞（1993-），女，碩士研究生，研究方向：水產養(yǎng)殖動物病害。E-mail：t1164695014@163.com。

通信作者：馮守明（1965-），男，研究員，研究方向：水產動物病害。E-mail：smfeng@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2020.04.008