周福江，伍成斌，高守霞，徐 超，錢文楹，黃秋蘭

（上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201802）

目前，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其治療方法多采用免疫抑制治療和抗炎治療，但僅能延緩病情的發(fā)展。吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）為色氨酸（tryptophan，Trp）代謝中重要的酶，在人和動物的許多組織中均正常表達(dá)，但易受細(xì)菌、病毒感染帶來的致炎因子誘導(dǎo)。當(dāng)IDO表達(dá)升高時(shí)，可生成犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）等促凋亡因子，抑制免疫細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)免疫耐受狀態(tài)[1]。色胺酰-tRNA合成酶（tryptophanyltRNA-synthetase，TTS ）可拮抗IDO對色氨酸的消耗，通過含色氨酸蛋白的合成而維持細(xì)胞的生存和分裂[2]。因此，IDO與TTS可能共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)色氨酸的代謝和免疫反應(yīng)。為此，本研究擬探討IDO、TTS在RA中的臨床價(jià)值，以期能為RA的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2018年12月上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院收治的88例RA患者，其中男46例、女性42例，年齡18～69歲，診斷均符合2010年美國風(fēng)濕病協(xié)會/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18周歲；（2）脾臟輕度腫大或不腫大。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重的糖尿病、高血壓；（2）合并其他自身免疫性疾病或慢性感染性疾??；（3）采樣前1個(gè)月內(nèi)有糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療史；（4）各項(xiàng)檢測指標(biāo)不完整；（5）患有嚴(yán)重的精神疾病。根據(jù)改良疾病活動指數(shù)28（disease activity score 28，DAS28）評分[4]將RA患者分為低活動度組（35例，DAS28≤3.2分）、中活動度組（42例，DAS28為＞3.2分～≤5.1分）和高活動度組（11例，DAS28＞5.1分）。參照PREVOO等[5]的方法計(jì)算DAS28評分。選取同期上海市嘉定區(qū)南翔醫(yī)院體檢健康者88名（正常對照組），其中男50名、女38名，年齡18～65歲。

1.2 樣本采集

采用肝素抗凝管和乙二胺四乙酸抗凝管分別采集所有對象靜脈血4 mL，以600×g離心10 min，吸取上層血漿，-80℃保存待測。含血細(xì)胞的沉淀用于流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測，24 h內(nèi)完成檢測。

1.3 高效液相色譜法檢測血漿Kyn、Trp水平

1.3.1 儀器和試劑 Agilent1100高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，乙腈（色譜純）購自美國天地公司，Kyn和Trp 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma-Aldrich公司（貨號分別為K3750、T8941），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3.2 樣本預(yù)處理 取400 μL血漿，用400 μL 0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH值6）對倍稀釋，加入2 mol/L三氯乙酸100 μL沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，靜置10 min，4℃ 15000×g離心10 min，沉淀血漿蛋白，取上清300 μL進(jìn)樣分析。

1.3.3 色譜條件 Agilent Hypersil RP-C18色譜柱（125.0 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.015 mol/L磷酸鉀溶液（pH值6.4）∶乙腈=95∶5（V/V），流速為0.5 mL/min，柱溫為25℃；在波長為350 nm的紫外光處檢測Kyn水平，在激發(fā)波長為284 nm和365 nm處測定Trp水平，計(jì)算Kyn/Trp比值。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞內(nèi)IDO和TTS的表達(dá)

1.4.1 儀器和試劑 FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD45抗體（FITC-CD45）、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的小鼠抗人IDO抗體（APC-IDO）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的兔抗人TTS抗體（PE-TTS）、PE標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體（PE-IgG）、APC標(biāo)記的小鼠IgG1同型對照、APC標(biāo)記的兔IgG1同型對照、固定/破膜劑（Fixation/Permeabilization Solution Kit）和流式染色緩沖液（Flow Cytometry Staining Buffer）均購自美國BD公司。Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)分析 首先建立流式細(xì)胞術(shù)IDO/TTS檢測模板。取肝素抗凝血樣本4 mL，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）后，將PBMC濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，用吸管吹打混勻至單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液，加入10 μL FITCCD45，4℃避光染色30 min。用2 mL預(yù)冷的染色緩沖液200×g離心洗滌5 min，棄上清，旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1 mL 1×固定/破膜劑，再次旋渦震蕩混勻，4℃避光放置30 min，再次加入2 mL預(yù)冷的染色緩沖液，200×g離心洗滌5 min，棄上清，加入5 μL APC-IDO（1∶100稀釋）和10 μL PE-TTS（1∶100稀釋），4℃避光染色30 min，加入2 mL預(yù)冷的染色緩沖液，200×g離心洗滌5 min，棄上清。在檢測管中加入5 μL PEIgG，4℃避光染色30 min，加入2 mL預(yù)冷的染色緩沖液，200×g離心洗滌5 min，棄上清，每管中加入200 μL磷酸鹽緩沖液后，上機(jī)檢測。采用CellQuest軟件（美國BD公司）分析，調(diào)整前向及側(cè)向角，圈出CD45+細(xì)胞，定義為淋巴細(xì)胞群，從中獲取10000個(gè)細(xì)胞，檢測TTS及IDO熒光強(qiáng)度。

1.5 采用熒光定量RT-PCR測定PBMC中IDO mRNA和TTS mRNA的表達(dá)

1.5.1 儀器和試劑 LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自瑞士羅氏公司，SYBR PrimeScrip RT-PCR Kit Ⅱ（貨號為DRR083S）購自日本TaKaRa公司，Trizol試劑（貨號為15596-026）購自美國Invitrogen公司。

1.5.2 熒光定量RT-PCR檢測 采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，抽提新鮮分離PBMC中的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測IDOmRNA、TTSmRNA的表達(dá)，計(jì)算IDOmRNA/TTSmRNA比值。（1）引物設(shè)計(jì)和合成：在Genbank中查找IDO和TTS的mRNA已知序列，并用BLAST軟件在Genbank中設(shè)計(jì)IDO和TTS的特異性引物序列，同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參照基因β-actin的引物序列，引物由美國Invitrogen公司合成，序列見表1。（2）PCR反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)，溫度轉(zhuǎn)換率為20℃/s；擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔點(diǎn)曲線檢測（45～90℃，升溫速度0.2℃/s，連續(xù)檢測熒光）。（3）計(jì)算相對表達(dá)量：擴(kuò)增結(jié)束后，采用配套軟件進(jìn)行檢測和分析，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IDOmRNA和TTSmRNA的相對表達(dá)量，并計(jì)算IDOmRNA/TTSmRNA比值。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。趨勢檢驗(yàn)采用Cochran Armitage趨勢檢驗(yàn)（對應(yīng)的計(jì)量資料按總均值轉(zhuǎn)化成兩分類資料）。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估IDO/TTS比值在排除RA中的價(jià)值和在RA病情評估中的價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA組與正常對照組血漿Kyn、Trp水平和Kyn/Trp比值的比較

RA組血漿Kyn、Trp水平均高于正常對照組（P=0.000），Kyn/Trp比值低于正常對照組（P=0.000）。見表2。

表2 RA組與正常對照組血漿Kyn、Trp水平和Kyn/Trp比值的比較

表2 RA組與正常對照組血漿Kyn、Trp水平和Kyn/Trp比值的比較

2.2 RA組與正常對照組淋巴細(xì)胞中IDO、TTS、IDO/TTS比值的比較

RA組淋巴細(xì)胞中TTS表達(dá)高于正常對照組（P=0.000），IDO和IDO/TTS比值均低于正常對照組（P=0.000）。見表3、圖1、圖2。

2.3 RA組與正常對照組IDO mRNA、TTS mRNA的相對表達(dá)量及IDO mRNA/TTS mRNA比值的比較

RA組TTSmRNA相對表達(dá)量高于正常對照組（P=0.000），IDOmRNA相對表達(dá)量和IDOmRNA/TTSmRNA比值均低于正常對照組（P=0.000）。見表4。

2.4 不同疾病活動度各組IDO/TTS比值的比較

低活動度組、中活動度組及高活動度組之間IDO/TTS比值依次降低，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表3 RA組與正常對照組淋巴細(xì)胞IDO、TTS、IDO/TTS比值比較

表3 RA組與正常對照組淋巴細(xì)胞IDO、TTS、IDO/TTS比值比較

圖1 正常對照者淋巴細(xì)胞IDO和TTS的表達(dá)

圖2 RA患者淋巴細(xì)胞IDO和TTS的表達(dá)

表4 RA組與正常對照組IDO mRNA、TTS mRNA的相對表達(dá)量及IDO mRNA/TTS mRNA比值的比較

表4 RA組與正常對照組IDO mRNA、TTS mRNA的相對表達(dá)量及IDO mRNA/TTS mRNA比值的比較

表5 不同疾病活動度各組IDO/TTS比值的比較

表5 不同疾病活動度各組IDO/TTS比值的比較

注：趨勢檢驗(yàn)前將IDO/TTS比值數(shù)據(jù)按總體均值0.037進(jìn)行兩分類轉(zhuǎn)化，即1≥0.0370=否，趨勢檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Armitage χ2=7.632，P=0.022）

2.5 IDO/TTS比值在排除RA中的價(jià)值及對RA病情嚴(yán)重程度的判斷價(jià)值

以RA組為陽性樣本，正常對照組為陰性樣本，將IDO/TTS比值數(shù)據(jù)劃分成8個(gè)組段，建立排除RA模型的ROC曲線。結(jié)果顯示，IDO/TTS比值排除RA的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.841，最佳臨界值為0.080（即IDO/TTS比值＞0.080，可排除RA），敏感性為84.2%，特異性為81.6%，陰性預(yù)測值為0.838，陽性預(yù)測值為0.821，Youden指數(shù)為0.658。見圖3。

圖3 IDO/TTS比值排除RA的ROC曲線

因RA組中高活動度患者較少，故將病情嚴(yán)重程度分為2組：以高、中活動度患者為嚴(yán)重/陽性樣本（53例），以低活動度患者為非嚴(yán)重/陰性樣本（35例），將IDO/TTS比值數(shù)據(jù)劃分成8個(gè)組段，建立病情評估模型的ROC曲線。結(jié)果顯示，IDO/TTS比值判斷RA病情嚴(yán)重程度的AUC為0.734，最佳臨界值為0.042（即IDO/TTS比值＞0.042，RA病情更嚴(yán)重），敏感性為72.1%，特異性為70.7%，陰性預(yù)測值為0.626，陽性預(yù)測值為0.788，Youden指數(shù)為0.428。見圖4。

圖4 IDO/TTS比值判斷RA病情嚴(yán)重程度的ROC曲線

3 討論

Trp是人體必需的氨基酸，正常狀態(tài)下成人每天的Trp需求量為3 mg/kg[6]。IDO為含亞鐵血紅素的單肽鏈，是Trp沿Kyn代謝的關(guān)鍵酶[7]。健康人體內(nèi)IDO的表達(dá)率較低。當(dāng)人體內(nèi)IDO表達(dá)率上調(diào)和功能增強(qiáng)時(shí)，體內(nèi)Trp代謝加速，生成大量的Kyn，抑制免疫細(xì)胞的功能，阻斷T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受[8]。RA為慢性炎癥性自身免疫性疾病。有研究結(jié)果顯示，RA的發(fā)生、發(fā)展與關(guān)節(jié)內(nèi)免疫細(xì)胞的活化、聚集有關(guān)，可造成免疫調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)而造成組織、軟骨和骨損傷[9]。為此，本研究對IDO/TTS比值在排除RA中的價(jià)值及在RA病情評估中的價(jià)值進(jìn)行了探討，以期能為RA的治療和病情評估提供參考。

TTS可通過Trp在促進(jìn)T細(xì)胞對抗IDO介導(dǎo)的免疫抑制過程中發(fā)揮雙重保護(hù)作用，一方面可促使更多的Trp用于合成蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]；另一方面可抑制IDO介導(dǎo)的代謝作用，降低毒性代謝產(chǎn)物的生成，從而增加RA患者體內(nèi)反應(yīng)型T細(xì)胞的生成與增殖[11]。Trp經(jīng)TTS催化結(jié)合后，可增加細(xì)胞內(nèi)Trp的儲備，調(diào)節(jié)Trp的代謝過程，進(jìn)而調(diào)控免疫應(yīng)答[12]。IDO和TTS可參與到Trp的代謝過程中，對多種自身免疫性疾病進(jìn)行調(diào)控，因此Kyn/Trp比值可用于評估IDO活性[13]。本研究結(jié)果顯示，RA組血漿Kyn、Trp水平均高于正常對照組（P=0.000），Kyn/Trp比值低于正常對照組（P=0.000）；RA組淋巴細(xì)胞TTS表達(dá)及TTSmRNA相對表達(dá)量均高于正常對照組（P=0.000），IDO表達(dá)量、IDO/TTS比值、IDOmRNA相對表達(dá)量及IDOmRNA/TTSmRNA比值均低于正常對照組（P=0.000）。這可能是由于IDO可促進(jìn)Trp消耗，抑制細(xì)胞免疫，而TTS可與Trp結(jié)合而維持細(xì)胞免疫，TTS可拮抗IDO對Trp的代謝和消耗，如TTS表達(dá)升高可造成Trp代謝失衡，因此IDO和TTS共同參與了體內(nèi)Trp的代謝，在免疫性疾病中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用[14]。由此可見，外周血淋巴細(xì)胞中Trp代謝失調(diào)可能與RA的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞的激活及對自身組織的持續(xù)破壞，最終會導(dǎo)致RA的發(fā)生和發(fā)展[15]。

本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，IDO/TTS比值排除RA的最佳臨界值為0.080（IDO/TTS比值＞0.080，可排除RA），AUC、敏感性和特異性均高于0.8；判斷RA病情嚴(yán)重程度的最佳臨界值為0.042，AUC、敏感性和特異性均高于0.7。由此可見，IDO/TTS比值對RA有較好排除價(jià)值，對RA病情也有較好的評估價(jià)值。

IDO（IDOmRNA）、TTS（TTSmRNA）與IDO/TTS比值（IDOmRNA/TTSmRNA）有直接的換算關(guān)系，且IDO、TTS指標(biāo)較對應(yīng)的mRNA測定更為簡便，因此可以考慮以淋巴細(xì)胞的IDO/TTS比值作為RA患者的病情評估指標(biāo)。IDO是炎癥性自身免疫性疾病的致病介質(zhì)[13]。本研究結(jié)果顯示，RA患者IDO表達(dá)高于正常對照者（P=0.000）。MERLO等[16]的研究結(jié)果顯示，抗IDO2單抗治療小鼠RA模型有效。提示抗IDO單抗靶向治療RA可能是未來RA免疫治療的潛在策略。

綜上所述，RA患者外周血、T細(xì)胞內(nèi)Trp代謝途徑失調(diào)。IDO/TTS比值對RA有較高的排除價(jià)值，亦可用于RA病情的評估。本研究為RA的發(fā)病機(jī)制研究提供了參考，也為病情評估和尋找新的治療策略開拓了新的思路。