鄭培明，崔發(fā)財，張福明，李 剛

（河南省人民醫(yī)院 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450003）

2019年12月以來，湖北省武漢市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例新型冠狀病毒肺炎患者，隨著疫情的蔓延，我國其他地區(qū)及國外也相繼發(fā)現(xiàn)了此類病例[1]。新型冠狀病毒屬于β屬的冠狀病毒，其基因特征與急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）有明顯區(qū)別。有研究結(jié)果顯示，新型冠狀病毒與蝙蝠嚴重急性呼吸綜合征樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達85%以上[2-3]，國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組將其命名為“嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2”（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），由其引發(fā)的疾病被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式命名為新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）。我國國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》提及的診斷標(biāo)準中，確診病例在原有核酸檢測和測序基礎(chǔ)上增加血清學(xué)檢測作為依據(jù)，即“新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG陽性”或“新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期有4倍及以上升高”也可確診[3]。目前，市場上也已有多種商品化SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測試劑，主要有化學(xué)發(fā)光法和膠體金法2種快速檢測技術(shù)。本研究擬采用不同檢測方法對25例COVID-19患者進行血清IgM和IgG抗體檢測，探討其在SARS-CoV-2感染診斷中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2020年2月以來河南省人民醫(yī)院確診的COVID-19患者25例（COVID-19組），其中男12例、女13例，年齡26～90歲，其中重型患者19例，發(fā)病天數(shù)為15～30 d，平均為23 d，診斷標(biāo)準符合《新型冠狀病毒感染肺炎的診療方案（試行第七版）》，核酸檢測均為陽性。另選取同期在發(fā)熱門診就診且排除COVID-19的患者20例作為對照組，其中男10例、女10例，年齡24～76歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用含分離膠的真空采血管采集所有對象空腹靜脈血5 mL，靜置待血液凝固，2500×g離心5 min，分離血清。

1.2.2 膠體金法檢測血清SARS-CoV-2抗體 膠體金法采用免疫層析技術(shù)原理，使用間接法檢測血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，試劑盒由廣州達瑞科技有限公司生產(chǎn)。檢測線與質(zhì)控線均顯色，判定為陽性。

1.2.3 化學(xué)發(fā)光法檢測血清SARS-CoV-2抗體 采用VI-200全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（北京中航賽維生物科技有限公司）及配套試劑（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）檢測血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，其中IgM抗體采用捕獲法檢測，IgG抗體采用間接法檢測。測定結(jié)果以相對發(fā)光強度（relative light unit，RLU）表示，樣本中的IgM或IgG抗體水平與RLU呈正相關(guān)。儀器根據(jù)RLU及內(nèi)置校準曲線自動計算出IgM或IgG抗體水平（AU/mL），以檢測結(jié)果≥8.0 AU/mL為陽性。

1.2.4 其他項目的檢測 采用UPT-3A-1200上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀（北京熱景生物技術(shù)股份有限公司）及配套試劑（雙抗體夾心免疫層析法）檢測降鈣素原（procalcitonin，PCT）水平。采用cobas c501/e601全自動生化免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑檢測C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）及鐵蛋白，其中CRP用c501模塊（散射免疫比濁法）檢測，鐵蛋白用e601模塊（電化學(xué)發(fā)光法）檢測。

2 結(jié)果

2.1 膠體金法與化學(xué)發(fā)光法檢測血清SARSCoV-2 IgG抗體的比較

化學(xué)發(fā)光法和膠體金法檢測COVID-19組血清SARS-CoV-2 IgG抗體的陽性率（敏感性）分別為56%（14/25）和76%（19/25）。2種方法聯(lián)合檢測的陽性率（敏感性）為88%（22/25）?；瘜W(xué)發(fā)光法與膠體金法檢測對照組血清SARSCoV-2 IgG抗體均為陰性，特異性均為100%。2種方法檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體的總符合率為75.6%（34/45）。見表1。

表1 膠體金法與化學(xué)發(fā)光法檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體的比較 /例

2.2 不同檢測方法SARS-CoV-2 IgM抗體檢測結(jié)果的比較

化學(xué)發(fā)光法和膠體金法檢測COVID-19組血清SARS-CoV-2 IgM抗體的陽性率（敏感性）分別為48%（12/25）和88%（22/25）。2種方法聯(lián)合檢測的陽性率（敏感性）為96%（24/25）。化學(xué)發(fā)光法與膠體金法檢測對照組血清SARSCoV-2 IgM抗體均為陰性，特異性均為100%。2種方法檢測血清SARS-CoV-2 IgM抗體的總符合率為68.9%（31/45）。見表2。

表2 膠體金法與化學(xué)發(fā)光法檢測血清SARS-CoV-2 IgM抗體的比較 /例

2.3 COVID-19患者不同檢測方法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體陽性率比較

化學(xué)發(fā)光法和膠體金法檢測COVID-19組血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體雙陽性率分別為36%（9/25）和76%（19/25），IgM抗體單陽性率分別為12%（3/25）和12%（3/25），IgG抗體單陽性率分別為20%（5/25）和0%（0/25）。

2.4 COVID-19患者血清炎性指標(biāo)的變化

25例COVID-19患者中有9例（36%）患者PCT水平升高，最高達10 ng/mL，但大多數(shù)患者低于0.5 ng/mL；有18例（72%）CRP水平，最高者超過200 mg/L；有21例（84%）鐵蛋白水平升高，最高者超過2000 ng/mL。

3 討論

隨著對SARS-CoV-2感染認識的不斷加深，針對該疾病的診療方案和診斷標(biāo)準也在不斷地進行著更新和完善。在《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》之前的診療方案版本中，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測SARSCoV-2核酸陽性或基因測序結(jié)果與已知的SARSCoV-2高度同源一直是臨床疑似病例的確診標(biāo)準。目前，主要采用實時熒光定量PCR檢測SARS-CoV-2的核酸。然而，由于受樣本采集與存放、病毒感染部位、RNA提取方法及檢測試劑盒質(zhì)量問題等多方面因素的影響，核酸檢測陽性患者僅占臨床確診患者的50%左右。此外，實時熒光定量PCR操作繁瑣，檢測耗時較長，對人員及實驗場地等要求較高，不便于在基層醫(yī)院普遍開展，這些都給SARS-CoV-2感染的診斷及防疫、防控帶來巨大的不便[4-5]。當(dāng)病原體感染人體后，人體免疫系統(tǒng)會對病原體進行免疫防御并產(chǎn)生特異性抗體。因此，使用免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)檢測患者樣本中的特異性抗體也是一種常用的病原體感染快速診斷方法。IgM抗體是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，被喻為機體特異性抗感染的“先頭部隊”，檢測IgM抗體可早期診斷感染。IgG抗體產(chǎn)生較晚，但其血清水平較高、維持時間長、親和力高，因此IgG抗體陽性提示感染處于中后期或既往感染[6-7]。此外，抗體檢測對設(shè)備無特殊要求，操作簡便，在臨床診斷的時效性上有極大優(yōu)勢。國家衛(wèi)生健康委于2020年3月3日發(fā)布的《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》中已將血清學(xué)抗體檢測納入COVID-19的確診標(biāo)準中。

目前，國內(nèi)已經(jīng)有大批機構(gòu)進行SARSCoV-2抗體檢測試劑的研發(fā)和生產(chǎn)，部分廠商已研發(fā)出SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測試劑盒。由于COVID-19為全新的傳染病，抗體檢測對于SARS-CoV-2感染的診斷來說是一個全新的方法。假陰性和假陽性是任何體外檢測手段都無法避免的，因此在臨床大規(guī)模應(yīng)用之前有必要對不同抗體檢測方法的敏感性和特異性進行充分驗證。有研究結(jié)果顯示，采用化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體有較高的敏感性和特異性，可以作為SARS-CoV-2篩查和診斷的有效手段[8-9]。膠體金法檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體目前臨床報道較少。本研究采用化學(xué)發(fā)光及膠體金法2種不同的方法對25例COVID-19患者及20例對照者進行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測，結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體的敏感性分別為56%和48%，低于文獻報道[8]，膠體金法檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體的敏感性分別為76%和88%，檢出率相對較高。2種方法的特異性均為100%?？贵w檢測的敏感性主要取決于抗原抗體的親和力、檢測方法及操作。作為一種針對SARS-CoV-2的新型免疫學(xué)檢測方法，抗體檢測試劑盒基本都是新研發(fā)出來的，不同廠商在重組抗原的選擇、制備等方面的差異可能會影響重組抗原的抗原性。此外，針對抗體的不同檢測方法（雙抗原夾心法、間接法、捕獲法等）的差異也可能對試劑盒的敏感性、特異性產(chǎn)生影響。本研究使用的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法試劑盒分別采用間接法和捕獲法檢測IgG、IgM抗體，檢測體系相對完善，自動化程度較高，從理論上說其敏感性應(yīng)該較高。造成敏感性較低和假陰性出現(xiàn)的原因可能與重組抗原的制備及包被有關(guān)。IgM抗體的檢出率低（48%），原因可能是在采用捕獲法檢測IgM抗體時，酶標(biāo)記重組抗原影響了抗原與抗體的結(jié)合力。2種檢測方法的特異性均可達到100%，說明制備的SARS-CoV-2重組抗原特異性好。

《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》提及的實驗室檢查中，多數(shù)患者CRP和血沉升高，PCT正常。本研究結(jié)果顯示，25例COVID-19患者中有36%的患者PCT升高，有72%的患者CRP升高，與《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》相符。本研究結(jié)果還顯示，有84%的患者鐵蛋白水平升高，因此鐵蛋白或可作為COVID-19的輔助診斷指標(biāo)。

總之，血清抗體檢測方法具有樣本采集方便、操作簡單快速，可作為SARS-CoV-2核酸檢測的有效補充。然而，在臨床大規(guī)模應(yīng)用前仍需優(yōu)化各類檢測技術(shù)，并進行認真、有效的驗證，使質(zhì)量更加可靠的檢測試劑盡早用于COVID-19的臨床診斷。由于本研究的樣本量較小，因此結(jié)論具有一定的局限性。相信隨著對SARS-CoV-2研究的深入，相關(guān)檢測技術(shù)和方法會逐漸成熟，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測技術(shù)將會更多地應(yīng)用到COVID-19的篩查和診斷中，更好地指導(dǎo)臨床診療工作。