鞏 臣，張炎杰，張 檬，石峙岳，劉 湘，柳 攀，廖曉玲，周 藝，劉 雪*

(1.重慶科技學(xué)院 納微復(fù)合材料與器件重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331；2.重慶科技學(xué)院 納微生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331；3.中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué) 神經(jīng)生物學(xué)教研室，重慶 400038)

動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是生物醫(yī)學(xué)研究的重要手段之一，在腦科學(xué)研究特別是高水平研究工作中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[1]。但由于動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是基于動(dòng)物活體的行為觀察，與傳統(tǒng)的生理、分子、細(xì)胞等研究手段差別較大，且專用行為學(xué)平臺(tái)價(jià)格不菲，這些因素從不同程度上阻礙了動(dòng)物行為學(xué)研究的推廣[2]。開(kāi)源系統(tǒng)，是20世紀(jì)80年代提出的概念，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于軟件的開(kāi)發(fā)等計(jì)算機(jī)學(xué)科中，其全稱為開(kāi)放源代碼，最大的特點(diǎn)是開(kāi)放，即任何人都可得到軟件的源代碼，可以加以修改，甚至在版權(quán)允許范圍之內(nèi)重新發(fā)放——因此，開(kāi)源系統(tǒng)特別適用于有意開(kāi)展動(dòng)物行為學(xué)研究但缺乏具體研究經(jīng)驗(yàn)的院校及課題組使用。

根據(jù)研究?jī)?nèi)容不同，動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)有多種類型。神經(jīng)科學(xué)中常見(jiàn)的動(dòng)物行為學(xué)范式包括穿梭箱避暗實(shí)驗(yàn)、水迷宮、Y迷宮、條件性位置偏好實(shí)驗(yàn)等。目前市面上大部分實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，運(yùn)用一種訓(xùn)練裝置只能進(jìn)行一種實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[3-5]，且受到設(shè)計(jì)專利和軟件著作權(quán)的影響，在源代碼未知的情況下，使得購(gòu)買的裝置無(wú)法自主調(diào)整或擴(kuò)展進(jìn)行同類實(shí)驗(yàn)研究，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的個(gè)性化實(shí)驗(yàn)需求，因此迫切需要一種開(kāi)源的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)來(lái)滿足靈活的訓(xùn)練需求。

穿梭箱作為行為學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)設(shè)備應(yīng)用廣泛，具有潛在的多樣化實(shí)驗(yàn)需求，因而我們基于開(kāi)源共享協(xié)議，以傳統(tǒng)穿梭箱裝置為基礎(chǔ)[6-7]設(shè)計(jì)研發(fā)了一套多功能大鼠穿梭箱訓(xùn)練系統(tǒng)，在進(jìn)一步加強(qiáng)穿梭箱訓(xùn)練裝置的靈活性和協(xié)同性的同時(shí)，降低動(dòng)物學(xué)習(xí)行為研究的門(mén)檻并提高實(shí)驗(yàn)效率，深入研究大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。該裝置具有高度靈活性，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自己的需求更改配置，實(shí)現(xiàn)多種條件刺激聯(lián)合訓(xùn)練的功能。

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)完全開(kāi)源，其下載地址為:https://github.com/Barzarrhey/Labview。實(shí)驗(yàn)者可以自行更改程序代碼，適配于不同種動(dòng)物行為探究實(shí)驗(yàn)，如切斷電刺激，設(shè)定人工照明，即可作為曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)研究裝置；將箱體兩側(cè)用隔板隔開(kāi)，即可作場(chǎng)景恐懼研究實(shí)驗(yàn)裝置；更改箱體材料透明度，可用作明暗箱實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建開(kāi)源平臺(tái)可以讓用戶根據(jù)自身需求修改設(shè)置，具有更廣闊的使用空間。程序開(kāi)源使得實(shí)驗(yàn)者更好的掌握程序運(yùn)行原理，可以更好的選擇與之相配套的裝置進(jìn)行升級(jí)改裝工作。在數(shù)據(jù)處理、實(shí)驗(yàn)步驟等方面逐漸建立一套標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有利于他人在使用時(shí)能快速熟悉實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以訓(xùn)練大鼠在復(fù)雜環(huán)境下認(rèn)知學(xué)習(xí)，訓(xùn)練環(huán)境更貼近現(xiàn)實(shí)，使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析更加簡(jiǎn)便、客觀、真實(shí)，有利于神經(jīng)科學(xué)的研究[8-9]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡SD雄性大鼠38只，體重240～260 g，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心[SCXK(渝)2017-0002]，于陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)并取材[SYXK(渝)2017-0002]，相對(duì)濕度70%，環(huán)境溫度(24±2)℃，光照12 h/12 h明暗交替，并按照3R原則(replacement，reduction，refinement)給以人道關(guān)懷。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)為傳統(tǒng)單音頻訓(xùn)練組混合音頻訓(xùn)練組每組分配4只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為傳統(tǒng)訓(xùn)練組和穿梭箱混合訓(xùn)練組每組分配5只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。為正常動(dòng)物與習(xí)得場(chǎng)景恐懼模型動(dòng)物對(duì)比實(shí)驗(yàn)組分配10只動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)組成

本實(shí)驗(yàn)由穿梭箱體、控制電路、檢測(cè)電路、刺激電路、單片機(jī)、上位機(jī)和開(kāi)源系統(tǒng)組成。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)裝置主體

實(shí)驗(yàn)裝置主體按照傳統(tǒng)穿梭箱體設(shè)計(jì)，箱體材質(zhì)為黑色啞光亞克力有機(jī)玻璃，規(guī)格為140 cm×60 cm×70 cm，分為箱體和蓋板兩部分，蓋板中間安置有紅外高清攝像頭。箱體內(nèi)部中間位置設(shè)垂直隔板，將箱體分為A、B兩室，隔板中間有通道使得兩室相通。兩室下方為間隔0.5 cm的不銹鋼材質(zhì)的鋼柵。在施加非條件刺激時(shí)，外接直流電源連通，電擊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物足底，引起痛覺(jué)從而達(dá)到刺激的效果。鋼柵底部有可活動(dòng)的抽屜，用于承接動(dòng)物排泄物，便于清理。兩室頂部有燈泡(光刺激)和揚(yáng)聲器(聲刺激)，用來(lái)產(chǎn)生條件刺激。結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1。

1.2.2 檢測(cè)電路

箱體頂部安裝有紅外高清攝像頭，通過(guò)USB接口與上位機(jī)連接，配合計(jì)算機(jī)圖像識(shí)別算法，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)動(dòng)物所在位置，供計(jì)算機(jī)處理分析。

1.2.3 刺激電路

刺激電路由單片機(jī)、繼電器、上位機(jī)組成。在僅使用單個(gè)箱體實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用雙路繼電器，兩個(gè)常閉口分別接箱體底部偶數(shù)鋼柵，奇數(shù)鋼柵接地。為提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)對(duì)多只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)亦最多兼容四路穿梭箱同時(shí)運(yùn)行，此時(shí)可采用八路繼電器。在需要產(chǎn)生非條件刺激時(shí)，上位機(jī)通過(guò)USB串口與單片機(jī)通訊，單片機(jī)產(chǎn)生TTL電平信號(hào)控制繼電器的開(kāi)合。繼電器接有直流恒流電源，電流強(qiáng)度可調(diào)(建議0.5～1 mA)，見(jiàn)圖2所示。

1.2.4 軟件設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)依托Labview軟件設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，系統(tǒng)程序界面截圖如圖3所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic diagram of experimental device

圖2 刺激電路圖Figure 2 Stimulation circuit diagram

圖3 軟件界面Figure 3 The software interface

軟件系統(tǒng)設(shè)計(jì)采用框架結(jié)構(gòu)，軟件界面下可對(duì)各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，每項(xiàng)參數(shù)都有默認(rèn)值，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在實(shí)驗(yàn)前或是實(shí)驗(yàn)適應(yīng)期間對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行調(diào)試，本次實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定的參數(shù)如下:(1)訓(xùn)練通道(可最多選擇四路同時(shí)進(jìn)行)；(2)訓(xùn)練間隔時(shí)間；(3)條件刺激時(shí)長(zhǎng)；(4)非條件刺激時(shí)長(zhǎng)；(5)條件刺激(音頻)頻率；(6)條件刺激時(shí)間間隔；(7)非條件刺激電流強(qiáng)度；(8)訓(xùn)練次數(shù)。

系統(tǒng)軟件提供了動(dòng)物穿梭狀況的波形圖窗口。通過(guò)這個(gè)窗口可以得到動(dòng)物每次穿梭的時(shí)間點(diǎn)，波峰表示大鼠在A室，波谷表示動(dòng)物在B室，波形發(fā)生翻轉(zhuǎn)，則表示大鼠發(fā)生了穿梭行為，系統(tǒng)通過(guò)分析可自動(dòng)計(jì)算大鼠行為成功率。大鼠每次穿梭都在波形圖中有相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)，可分析動(dòng)物反應(yīng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也更加全面細(xì)致。

箱體頂部配以高清攝像頭，采集到的圖像單個(gè)像素流明值范圍為0～255，采樣范圍為A、B箱室，采樣速率為每秒5張。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)設(shè)定參數(shù)，標(biāo)定樣張，放入實(shí)驗(yàn)大鼠后，以每秒5張速率采樣，將采樣圖片與樣張對(duì)比，采樣圖片中的大鼠會(huì)改變圖片中其所在位置的流明值，兩者比較，計(jì)算出采樣圖片與樣張相比流明值變化最大的地方，即為采樣圖片中大鼠的位置。把圖片分為A、B兩區(qū)域，將圖片中大鼠位置與之照應(yīng)，即可確定大鼠在采樣圖片時(shí)所處的位置。播放音頻時(shí)，記錄大鼠位置，播放完畢后，記錄大鼠位置，通過(guò)前后位置對(duì)比，結(jié)合音頻種類，可自行判斷大鼠行為正確與否，如果行為錯(cuò)誤，上位機(jī)發(fā)送特定字符串給單片機(jī)，單片機(jī)讀碼后控制繼電器閉合，使得大鼠當(dāng)前所在區(qū)域刺激電路接通，大鼠遭受電擊懲罰，大鼠為躲避電刺激穿梭到對(duì)側(cè)區(qū)域，此過(guò)程稱為被動(dòng)回避反應(yīng)(passive avoidance response，PAR)或逃避反應(yīng)(escape response，ER)。條件刺激過(guò)后，單片機(jī)控制繼電器斷開(kāi)，結(jié)束通電刺激。如果在音頻播放停止之前發(fā)生穿梭行為，即發(fā)生了主動(dòng)回避反應(yīng)(active avoidance response，AAR)[10-11]。

1.2.5 場(chǎng)景恐懼(fear-condition)實(shí)驗(yàn)

嚙齒類動(dòng)物在恐懼時(shí)會(huì)表現(xiàn)出特有的凝滯狀態(tài)(freezing)，包括暫時(shí)抑制除呼吸運(yùn)動(dòng)外的所有的身體運(yùn)動(dòng)[12]。本裝置可進(jìn)行場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)程序的更改和設(shè)備調(diào)試，測(cè)試了環(huán)境更換對(duì)大鼠場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)反射模式的影響。本裝置可以用隔板將左右箱室隔開(kāi)，僅用一個(gè)箱室配合足底電刺激金屬柵桿、頂部攝像頭、實(shí)驗(yàn)程序便可以完成場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)程序需要更改的部分包括:(1)改變雙音頻訓(xùn)練邏輯，將危險(xiǎn)音頻信號(hào)播放概率調(diào)為100%；(2)將調(diào)整訓(xùn)練間隔時(shí)間、條件刺激時(shí)長(zhǎng)、非條件刺激時(shí)長(zhǎng)、訓(xùn)練次數(shù)，使之與場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練要求相匹配。訓(xùn)練開(kāi)始后，觀察主界面中穿梭箱內(nèi)實(shí)時(shí)畫(huà)面，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在條件刺激響起過(guò)程中、條件刺激間隔過(guò)程中的凝滯時(shí)間，計(jì)算凝滯時(shí)長(zhǎng)占總實(shí)驗(yàn)時(shí)間的比率。

1.2.6 明暗箱實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)裝置可將一側(cè)的箱室換為透明亞克力板，并加裝白熾燈，實(shí)驗(yàn)時(shí)保持常亮狀態(tài)。撤除一切條件刺激、非條件刺激，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)通過(guò)主界面監(jiān)控箱體內(nèi)老鼠狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在設(shè)定時(shí)間內(nèi)穿梭次數(shù)以及分別在明箱的滯留時(shí)間。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 穿梭箱單音頻訓(xùn)練

實(shí)驗(yàn)主要參數(shù)如下:(1)訓(xùn)練通道1(可最多選擇四路同時(shí)進(jìn)行)；(2)訓(xùn)練間隔時(shí)間為24 h；(3)條件刺激時(shí)長(zhǎng)7 s；(4)非條件刺激時(shí)長(zhǎng)15 s；(5)條件刺激(音頻)頻率8 kHz；(6)條件刺激間隔25 s；(7)非條件刺激電流強(qiáng)度5 mA；(8)訓(xùn)練次數(shù)50次。點(diǎn)擊標(biāo)定按鈕，將穿梭箱內(nèi)部流明值存入系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)裝置即設(shè)定完成。

將動(dòng)物放入穿梭箱內(nèi)，按照程序設(shè)定適應(yīng)時(shí)間讓其適應(yīng)環(huán)境，期間不施加任何刺激。適應(yīng)完成后，播放音頻，播放完畢0.1 s內(nèi)系統(tǒng)判斷動(dòng)物所在位置，如果與初始位置相同，通電刺激；如果與初始位置不相同，則不通電。每天連續(xù)重復(fù)過(guò)程50次，持續(xù)7 d。

1.3.2 穿梭箱雙音頻訓(xùn)練

按照傳統(tǒng)單音頻訓(xùn)練方法訓(xùn)練4 d后，改為低音頻訓(xùn)練。將條件刺激頻率改為2 kHz，改變程序邏輯，低頻音播放完畢，判定大鼠是否穿梭，如果大鼠穿梭到對(duì)側(cè)區(qū)域，則通電刺激，如果大鼠滯留于當(dāng)前區(qū)域，則不通電，其余參數(shù)不變，持續(xù)2 d。

后改用雙音頻訓(xùn)練，高低音頻出現(xiàn)概率各50%，條件刺激(音頻)頻率為8 kHz高頻音，2 kHz低頻音；其余參數(shù)不變，訓(xùn)練持續(xù)4 d。

1.3.3 場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)

取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5只，訓(xùn)練第1天，將大鼠放入改裝后的裝置內(nèi)適應(yīng)5 min。適應(yīng)時(shí)間結(jié)束后給聲音刺激20 s，聲音結(jié)束后給電刺激8 s，電流大小5 mA，電刺激結(jié)束后等待200 s，這樣為一個(gè)訓(xùn)練周期，總共訓(xùn)練6個(gè)周期。觀察整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程內(nèi)小鼠的狀態(tài)，記錄200 s間隔時(shí)間內(nèi)凝滯時(shí)間、聲音刺激20 s內(nèi)凝滯時(shí)間，電刺激后的20 s內(nèi)的凝滯時(shí)間。第2天將小鼠放入長(zhǎng)方形箱子中(80 cm×60 cm×40 cm)，不施加電刺激，訓(xùn)練開(kāi)始后給20 s聲音刺激，后觀察200 s，繼續(xù)給聲音刺激，觀察200 s，總共循環(huán)訓(xùn)練3次，記錄200 s間隔得小鼠的凝滯時(shí)間和20 s聲音刺激中的凝滯時(shí)間。第3天，將大鼠放回原裝置內(nèi)，不施加任何刺激，8 min后取出，記錄8 min內(nèi)大鼠凝滯時(shí)間。

1.3.4 正常動(dòng)物與習(xí)得場(chǎng)景恐懼模型動(dòng)物對(duì)比實(shí)驗(yàn)

將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，每組5只。用隔板將裝置從中間隔開(kāi)，改變程序訓(xùn)練邏輯，使得裝置底部每間隔50 s通電10 s，通電電流5 mA，將一組訓(xùn)練動(dòng)物依次置于裝置一側(cè)20 min，使該組大鼠總共受到20次不可回避電刺激，從而建立一組習(xí)得場(chǎng)景恐懼記憶的動(dòng)物模型[1]。另一組動(dòng)物置于裝置內(nèi)但不通電，20 min后取出。

更改程序訓(xùn)練邏輯，訓(xùn)練間隔設(shè)為12 h，非條件刺激時(shí)長(zhǎng)7 s，其余參數(shù)與傳統(tǒng)單音頻穿梭箱訓(xùn)練方法一致，兩組動(dòng)物總共訓(xùn)練12次，統(tǒng)計(jì)訓(xùn)練成功率。

訓(xùn)練12次完成后，將訓(xùn)練裝置用隔板隔開(kāi)，將兩組動(dòng)物分別置于裝置一側(cè)進(jìn)行場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)，測(cè)試時(shí)間5 min，統(tǒng)計(jì)兩組大鼠僵直時(shí)間。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 穿梭箱單音頻訓(xùn)練結(jié)果

學(xué)習(xí)成功率＝動(dòng)物成功躲避電擊次數(shù)/總實(shí)驗(yàn)次數(shù)，系統(tǒng)軟件可以直接計(jì)算出高音頻訓(xùn)練、低音頻訓(xùn)練、高低音頻混合訓(xùn)練的成功率。成功率統(tǒng)計(jì)圖表如圖4(n＝4)。

大鼠實(shí)驗(yàn)成功率直接體現(xiàn)了大鼠的學(xué)習(xí)效率，是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要參數(shù)。設(shè)定成功率穩(wěn)定在70%以上即認(rèn)為實(shí)驗(yàn)達(dá)到預(yù)期成功率[13-14]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看到，采用該種訓(xùn)練系統(tǒng)后大鼠的學(xué)習(xí)成功率整體呈上升趨勢(shì)，第1天與第2天訓(xùn)練成功率存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.0166)，第3天訓(xùn)練結(jié)果與第1天存在極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.0032)，之后每一天成功率均上升且與第一天存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在實(shí)驗(yàn)第6天大鼠平均成功率均值達(dá)到70%以上，并在之后的實(shí)驗(yàn)中保持在80%以上，即系統(tǒng)設(shè)計(jì)達(dá)到要求。訓(xùn)練成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可進(jìn)一步做神經(jīng)、藥理等科研項(xiàng)目。

圖4 傳統(tǒng)單音頻訓(xùn)練成功率統(tǒng)計(jì)圖Figure 4 Traditional single audio training success rate statistics chart

2.2 穿梭箱雙音頻混合訓(xùn)練結(jié)果

在10 d的訓(xùn)練周期中，前4 d進(jìn)行高頻音訓(xùn)練，第5、6天進(jìn)行低頻音訓(xùn)練，最后4 d進(jìn)行高低頻音混合訓(xùn)練。由4只老鼠成功率均值統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看到，前4 d高頻音訓(xùn)練，大鼠訓(xùn)練成功率在逐漸增長(zhǎng)。第5天開(kāi)始切換為低頻音訓(xùn)練，大鼠成功率明顯提升。在第7～10天混合音頻訓(xùn)練中，訓(xùn)練成功率稍有回落，但在第9天成功率能夠超過(guò)70%，并且之后能夠維持在80%，該系統(tǒng)符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求[15-17]，見(jiàn)表1。

2.3 場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果

第1天的訓(xùn)練使大鼠逐步建立起場(chǎng)景恐懼記憶。第2天僅給聲音刺激信號(hào)，大鼠能夠在受到聲音刺激的20 s內(nèi)、200 s的間隔時(shí)間中表現(xiàn)出凝滯狀態(tài)，說(shuō)明大鼠已經(jīng)習(xí)得聲音的恐懼記憶，在第3天放入原實(shí)驗(yàn)裝置后，在8 min的測(cè)試時(shí)間里大鼠平均凝滯時(shí)間能達(dá)到150 s，說(shuō)明大鼠已經(jīng)建立起場(chǎng)景恐懼記憶，系統(tǒng)符合場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)要求，3 d的場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示(n＝5)。

2.4 正常動(dòng)物與習(xí)得場(chǎng)景恐懼模型動(dòng)物對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，正常大鼠訓(xùn)練成功率隨訓(xùn)練次數(shù)增加而逐漸增長(zhǎng)，而經(jīng)不可回避電刺激的大鼠訓(xùn)練成功率未呈現(xiàn)線性變化，成功率一直在20%以下。模型動(dòng)物和正常動(dòng)物在第3、5、6次訓(xùn)練成功率出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.0488、0.0103、0.0114)，正常動(dòng)物自第7次訓(xùn)練開(kāi)始成功率皆與模型組動(dòng)物呈現(xiàn)極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明不可回避電刺激嚴(yán)重影響了動(dòng)物主動(dòng)回避學(xué)習(xí)行為，正常動(dòng)物與模型組動(dòng)物12次穿梭箱訓(xùn)練結(jié)果如圖6所示(n＝10)。

表1 雙音頻混合訓(xùn)練成功率(±s，n＝4)Table 1 Dual audio mixing training results

表1 雙音頻混合訓(xùn)練成功率(±s，n＝4)Table 1 Dual audio mixing training results

組別Groups Day1成功率Success rate Day2成功率Success rate Day3成功率Success rate Day4成功率Success rate Day5成功率Success rate Day6成功率Success rate Day7成功率Success rate Day8成功率Success rate Day9成功率Success rate Day10成功率Success rate高頻音High frcqucncy audio training(13±2)%(25±4)%(42±6)%(57±2)% - - - - - -低頻音Low frcqucncy audio training---- (80±3)%(90±5)% - - - -混合組Mixing training - - - - - - (54±9)%(59±4)%(74±7)%(81±4)%

圖5 凝滯時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果Figure 5 Freezing time statistics

注:圖中12組數(shù)據(jù)依次代表大鼠12次穿梭箱訓(xùn)練結(jié)果。與正常大鼠對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。圖6 正常大鼠與習(xí)得場(chǎng)景恐懼記憶大鼠對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Note.The twelve groups of bars in the figure show the results of 12 shuttle box training sessions in rats.Compared with normal rat groups，*P＜0.05，**P＜0.01.Figure 6 Comparison of experimental results between normal rats and learned contextual fear memory rats

注:圖中兩列數(shù)據(jù)代表場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)大鼠的凝滯時(shí)間。與正常大鼠對(duì)照組比較，**P＜0.01。圖7 正常大鼠與習(xí)得場(chǎng)景恐懼記憶大鼠場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果Note.The bars in the figure show the freezing time of fear-condition test in rats.Compared with normal rat group，**P＜0.01.Figure 7 Results of fear-condition test in normal rats and learned contextual fear memory rats

圖7為兩組動(dòng)物場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，由訓(xùn)練結(jié)果可知，經(jīng)12次穿梭箱訓(xùn)練后，模型組動(dòng)物的凝滯時(shí)間與正常動(dòng)物相比存在極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＝0.00056)，綜合圖6所示的模型組動(dòng)物訓(xùn)練成功率顯著降低，說(shuō)明動(dòng)物已經(jīng)建立場(chǎng)景恐懼記憶，模型組動(dòng)物和正常動(dòng)物經(jīng)本裝置訓(xùn)練能夠在穿梭箱實(shí)驗(yàn)和場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)中體現(xiàn)出顯著性差異，說(shuō)明本裝置和開(kāi)源系統(tǒng)的設(shè)計(jì)符合動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

3 討論

單音頻訓(xùn)練結(jié)果符合預(yù)期[18]，訓(xùn)練結(jié)果從第2天開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第3天訓(xùn)練結(jié)果出現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明本裝置可以進(jìn)行傳統(tǒng)的穿梭箱實(shí)驗(yàn)。雙音頻訓(xùn)練結(jié)果在切換訓(xùn)練方式時(shí)有明顯的波動(dòng)。雙音頻混合訓(xùn)練第5、6天的訓(xùn)練成功率有明顯的提升，主要原因是大鼠在危險(xiǎn)環(huán)境中有一定的恐懼感，在沒(méi)有非條件刺激時(shí)，更傾向于選擇保持現(xiàn)狀，低頻音響起后，滯留于當(dāng)前區(qū)域?yàn)檎_行為，一定程度上契合了動(dòng)物習(xí)性，成功率也相對(duì)較高。第7天的訓(xùn)練成功率稍有回落，是由于高低音頻混合訓(xùn)練使得訓(xùn)練難度加大，大鼠需要適應(yīng)，在第9天成功率能夠上升至74%，說(shuō)明大鼠能夠成功分辨兩種聲音，該系統(tǒng)符合穿梭箱試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本實(shí)驗(yàn)要求。從正常動(dòng)物與習(xí)得場(chǎng)景恐懼記憶動(dòng)物對(duì)比實(shí)驗(yàn)中可知，施加不可回避電刺激的大鼠在穿梭箱實(shí)驗(yàn)和場(chǎng)景恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)果中均與正常大鼠有顯著性差異。施加不可回避電刺激、穿梭箱訓(xùn)練、場(chǎng)景恐懼訓(xùn)練均可在同一裝置同一系統(tǒng)內(nèi)完成，體現(xiàn)出開(kāi)源系統(tǒng)良好的適配性。且相同的實(shí)驗(yàn)裝置在重慶科技學(xué)院和陸軍軍醫(yī)大學(xué)使用時(shí)所作出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)類似，表明該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)作為一種標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以全面推廣。

動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的各種產(chǎn)品之間制造標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，在材質(zhì)、刺激標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)收集、處理以及實(shí)驗(yàn)方法等方面都有一定的差異，不同實(shí)驗(yàn)之間難以實(shí)現(xiàn)交叉。而開(kāi)源實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以極大程度地兼容各類軟件硬件，使得不同項(xiàng)目之間可以依托本程序平臺(tái)為基礎(chǔ)，靈活運(yùn)用不同硬件實(shí)現(xiàn)兼容運(yùn)行，所以開(kāi)源實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)能在統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方面做出極大的貢獻(xiàn)[19-20]。

借助開(kāi)源系統(tǒng)適配性廣的優(yōu)勢(shì)，本系統(tǒng)能夠提供多種模態(tài)的刺激，系統(tǒng)可滿足多種大鼠神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)需求，提供多模態(tài)刺激(聲、光、電等)，可測(cè)試不同的感官刺激對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)和行為決策的影響，并且每種模態(tài)可提供不同強(qiáng)度的刺激信號(hào)(如高低音刺激源，強(qiáng)弱光刺激源等)，可測(cè)試大鼠對(duì)不同程度刺激的反應(yīng)以及學(xué)習(xí)能力。系統(tǒng)底層代碼完全開(kāi)源，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自行調(diào)整，整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)全控化實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)設(shè)計(jì)合理，性能穩(wěn)定，減少了大量重復(fù)性勞動(dòng)，方便研究人員使用，有利于系統(tǒng)的廣泛推廣，加快系統(tǒng)升級(jí)。我們致力于將簡(jiǎn)單的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)開(kāi)源化、規(guī)范化，也希望更多的科研工作者能夠加入我們，打破技術(shù)壟斷，真正惠利于所有科研工作者。