王 琴，付 宇，王 平

(湖北省十堰市人民醫(yī)院 兒科，湖北 十堰 442000)

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌所引發(fā)的傳染性疾病，有研究表明，結(jié)核病為一種傳染性死亡的病因，肺結(jié)核的死亡率僅低于免疫缺陷病毒性疾病的死亡率，嚴(yán)重威脅著全球人類的身體健康，我國肺結(jié)核的發(fā)病率處于世界第二位，且隨著醫(yī)療費(fèi)用的不斷增長，研究肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制迫在眉睫[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)[2]miRNA與艾滋病、乙型病毒性肝炎、非典型肺炎、肺結(jié)核等多種感染性疾病的發(fā)生有關(guān)。Abdalla等[3]在其研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌可對(duì)miRNA產(chǎn)生改變作用，一方面可對(duì)巨噬細(xì)胞的死亡通路進(jìn)行調(diào)控，另一方面miRNA可促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌在人體細(xì)胞內(nèi)生存，對(duì)炎癥介質(zhì)的發(fā)生產(chǎn)生阻斷作用。Wagh等[4]研究結(jié)果顯示miR-16在肺結(jié)核患者中的水平顯著高于健康人，且Miotto等[5]在其研究證實(shí)miR-16水平的增加是在肺結(jié)核導(dǎo)致的溶血過程中所體現(xiàn)的。但目前對(duì)于miR-16作用于肺結(jié)核的機(jī)制臨床上尚未有研究，因此在本文研究中為研究miR-16在肺結(jié)核中的作用機(jī)制，建立肺結(jié)核模型小鼠，沉默miR-16的表達(dá)，以明確miR-16的作用機(jī)制，為臨床上肺結(jié)核的研究提供新方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)CD2F1雌性小鼠40只，體重18～29 g，8周齡，均購于中國科學(xué)院過程工程研究所[SCXK(京)2019-0004]，無菌手術(shù)在中國科學(xué)院過程工程研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(京)2019-0011]。所有小鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫在(22.1±1.8)℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間為一周。本文研究實(shí)驗(yàn)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC20190603)，并符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則。

1.1.2 菌株

標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核菌株H37Rv(購自加拿大GE Healthcare)。

1.2 主要試劑

PE標(biāo)記的小鼠抗人CD11b/Mac-1抗體、APC標(biāo)記的小鼠抗人CD33抗體、FITC標(biāo)記的小鼠抗人HLA-DR抗體、PE標(biāo)記的小鼠抗人CD3抗體、FITC標(biāo)記的小鼠抗人PD-1抗體(均購于美國艾美捷SouthernBiotec，貨號(hào)∶9546-09、9590-11、9568-16、9558-12、9550-08)；PBS緩沖液、Ficoll液(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)∶P1010、CS0024)；DHank’s液(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，貨號(hào)∶HMK0011)；小鼠抗大鼠IL-2抗體、小鼠抗大鼠IFN-γ抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號(hào)∶FNab09820、BA3383-2)；小鼠抗大鼠IL-15抗體(艾美捷科技有限公司，貨號(hào)∶5172-100)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢病毒載體構(gòu)建

miR-16表達(dá)抑制的慢病毒載體構(gòu)建及測定大鼠miR-16的序列查找和設(shè)計(jì)由廣州易錦公司完成。重組的LV-miR-16和LV-sponge(抑制載體)慢病毒表達(dá)載體由廣州易錦公司合成，并經(jīng)測序并測定慢病毒滴度，重組慢病毒，置于-80℃冰箱備用。

1.3.2 分組及建模

選取40只CD2F1雌性小鼠中10只作為正常組，其余小鼠均參照王青樂等[6]研究實(shí)驗(yàn)中肺結(jié)核小鼠模型的建立方法建立肺結(jié)核小鼠模型，使用標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核菌株H37Rv在ABSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室采用滴鼻法對(duì)進(jìn)行感染處理，菌液濃度為1×107CFU/mL，所有小鼠每只均滴鼻20μL，建立肺結(jié)核小鼠模型。在建模成功后，將肺結(jié)核小鼠隨機(jī)分為模型組、過表達(dá)組、沉默組各10只，沉默組小鼠肺部注射含10 μL miR-16抑制載體的慢病毒懸液，過表達(dá)組小鼠肺部注射含10μL miR-16表達(dá)載體的慢病毒懸液，正常組、模型組小鼠不做任何處理。

1.3.3 切片及染色

隨機(jī)各選取四組小鼠中任意1只，行全麻處理后，處死，在無菌、低溫條件下取小鼠肺組織，將小鼠肺組織在4%多聚甲醛中浸泡、固定，在溫度為4℃的環(huán)境下進(jìn)行保存。之后行HE染色處理，觀察病理組織變化。

1.3.4 T淋巴細(xì)胞亞群、胸腺指數(shù)檢測

取小鼠尾靜脈血2 mL，使用肝素鈉行抗凝處理，使用流式細(xì)胞儀檢測小鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平。胸腺指數(shù)測定:將小鼠的胸腺完全剝離，立即使用電子天平測定重量，計(jì)算胸腺指數(shù)，胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.3.5 肺炎癥指標(biāo)檢測

采用ELISA法檢測炎癥指標(biāo)，具體方法如下:將肺組織研磨成漿，取適量包被液(pH＝9.5，0.05 mol/L)稀釋，分別將0.1 mL抗IL-6、IL-10及TNFα置于聚苯乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)，并置于4℃放置過夜，應(yīng)用洗滌劑洗滌，向各孔分別加入Tris-HCl緩沖液(pH＝7.4，0.02 mol/L)稀釋待測標(biāo)本至0.1 mL，同法制作陰性與陽性對(duì)照，在43℃水浴恒溫保持1.0 h，移除液體并甩干。向各孔分別加入0.1 mL IL-6、IL-10及TNF-α的酶標(biāo)抗體，繼續(xù)在43℃水浴恒溫保持1.0 h，移除液體并甩干。向各孔中加入0.1 mL底物液(0.1 mol/L Na2HPO4(Na2HPO4·12H2O 35.8 g/L)+4.86 mL枸櫞酸(0.05 mol/L)+4 mg鄰苯二胺)，遮光放置30 min，再在各孔中加入終止液2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取波長為405 nm處的吸收值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肺組織的IL-6、IL-10及TNF-α水平。

1.3.6 TLRs信號(hào)通路因子檢測

采用熒光定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，25μL的反應(yīng)體系:2.5μL PCR緩沖液、1.5μL MgCl2、0.5μL上下游引物，加水至25μL。反應(yīng)條件:94℃60 s、55℃60 s、72℃60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延長5 min，采用2-△△Ct法計(jì)算待測的TLR2、TLR4、NFκB相對(duì)表達(dá)，每個(gè)樣品重復(fù)3次取均值，β-actin為內(nèi)參。TLR2:上游引物:5’-CTGAGCCTCGTCCATG CCACTC-3’；下游引物:5’-GGCCAGCAAATTACCT GTGTG-3’。TLR4:上游引物:5’-TGGATACGTTTC CTTATAAGG-3’；下游引物:5’-GAAATGGAGGCAC CCCTTC-3’。NF-κB:上游引物:5’-CAAGATCTTG CCGAGTAAACC-3’；下游引物:5’-TCGGAACACA ATGGCCACTT-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)分析本文的數(shù)據(jù)，其中計(jì)量資料，如IL-6、IL-10及TNF-α，采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(±s)方式進(jìn)行描述，多組間的計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般形態(tài)變化

正常組小鼠皮毛光滑有亮澤，精神狀態(tài)較好，飲食正常，無死亡。模型組小鼠皮毛無光澤、稀疏，反應(yīng)遲鈍，精神不佳，飲食減少，大便稀溏，其中2只小鼠因胸腔淤血死亡，另外8只小鼠肺部出現(xiàn)粟粒樣結(jié)節(jié)。過表達(dá)組小鼠皮毛較為稀疏，無光澤，精神萎靡，飲食明顯減少，其中3只小鼠因胸腔淤血死亡，另外7只小鼠肺部出現(xiàn)粟粒樣結(jié)節(jié)，并布滿整個(gè)肺部。沉默組小鼠，毛色恢復(fù)光澤，喜好活動(dòng)，精神狀態(tài)較好，飲食正常，偶爾出現(xiàn)大便干結(jié)，其中2只小鼠因胸腔淤血死亡，1只小鼠肺部出現(xiàn)粟粒樣結(jié)節(jié).

2.2 四組小鼠肺組織病理變化觀察

如圖1所示，正常組小鼠肺組織支氣管、肺泡清晰可見，無增生、滲出、壞死的出現(xiàn)；模型組小鼠肺組織形態(tài)發(fā)生病理改變，出現(xiàn)滲出、壞死現(xiàn)象；過表達(dá)組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理變化，有較為嚴(yán)重的滲出、壞死的發(fā)生；沉默組小鼠存在肺組織病理改變，可見有少量的增生和滲出現(xiàn)象，無壞死的發(fā)生。

2.3 四組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群、胸腺指數(shù)變化比較

如表1所示，模型組、過表達(dá)組、沉默組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)低于正常組，CD8+高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；過表達(dá)組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)低于模型組，CD8+高于模型組，沉默組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)高于模型組，CD8+低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；沉默組小鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、胸腺指數(shù)高于過表達(dá)組，CD8+低于過表達(dá)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

2.4 四組小鼠肺組織中炎癥因子表達(dá)水平比較

如表2所示，模型組、過表達(dá)組、沉默組小鼠IL-6、TNF-α水平高于正常組，IL-10水平低于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；過表達(dá)組小鼠IL-6、TNF-α水平高于模型組，IL-10水平低于模型組，沉默組小鼠IL-6、TNF-α水平低于模型組，IL-10水平高于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；沉默組小鼠IL-6、TNF-α水平低于過表達(dá)組，IL-10水平高于過表達(dá)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

注:A:正常組；B:模型組；C:過表達(dá)組；D:沉默組。圖1 四組小鼠肺組織病理變化HE染色圖Note.A，Control group.B，Model group.C，Overexpression group.D，Silence group.Figure 1 HE staining of lung histopathological changes in four groups of mice

表1 四組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群、胸腺指數(shù)變化比較(±s)Table 1 Changes of T lymphocyte subsets and thymus index in four groups of mice

表1 四組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群、胸腺指數(shù)變化比較(±s)Table 1 Changes of T lymphocyte subsets and thymus index in four groups of mice

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05；與過表達(dá)組相比，△P＜0.05。Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Compared with the overexpression group，△P＜0.05.

組別Groups例數(shù)Number of cases CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+(%)胸腺指數(shù)(mg/g)Thymus index正常組Control group 10 68.59±6.48 39.25±2.46 25.98±2.49 1.79±0.62 3.89±1.12模型組Model group 8 52.13±1.68* 23.25±1.01* 42.36±6.28* 0.61±0.26* 2.30±0.15*過表達(dá)組Overexpression group 7 43.58±0.67*＃ 19.58±0.27*＃46.59±9.58*＃ 0.54±0.15*＃ 2.04±0.04*＃沉默組Silent group 8 60.39±2.33*?！?1.45±3.58*?！?9.67±1.72*＃△1.15±0.23*?！?2.98±0.09*?！鱂 5.086 8.217 5.336 4.137 3.417 P 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001

表2 四組小鼠肺組織中炎癥因子表達(dá)水平比較(±s)Table 2 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissues of four groups of mice

表2 四組小鼠肺組織中炎癥因子表達(dá)水平比較(±s)Table 2 Comparison of expression levels of inflammatory factors in lung tissues of four groups of mice

注:與正常組比，*P＜0.05；與模型組比，＃P＜0.05；與過表達(dá)組比，△P＜0.05。Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Compared with the overexpression group，△P＜0.05.

組別Groups例數(shù)Number of cases IL-6(pg/mL) IL-10(pg/mL) TNF-α(ng/L)正常對(duì)照組Normal control group 10 30.23±1.12 76.59±9.56 6.45±0.57模型組Model group 8 58.69±3.45* 40.12±5.69* 23.59±2.16*過表達(dá)組Overexpression group 7 66.89±6.17*＃ 32.59±6.48*＃ 26.59±3.96*＃沉默組Silent group 8 42.58±2.96*?！?63.89±2.47*?！?13.24±1.12*?！鱂 18.331 5.461 25.104 P 0.001 0.001 0.001

2.5 沉默miR-16對(duì)肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號(hào)通路因子的影響

如表3所示，模型組、過表達(dá)組、沉默組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；過表達(dá)組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平高于模型組，沉默組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；沉默組小鼠TLR2、TLR4、NF-κB水平低于過表達(dá)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染所導(dǎo)致的疾病，主要通過呼吸道感染，可引發(fā)全身多器官病變，其中以肺結(jié)核最為常見，屬于一種臨床上較為常見的慢性傳染病，具有高患病率、高感染率、高耐藥率、高死亡率等特點(diǎn)。且近年來隨著HIV感染率的增加、多重耐藥因素的影響以及空氣污染的加重，導(dǎo)致肺結(jié)核的發(fā)病率逐漸升高[7]。目前隨著對(duì)肺結(jié)核的深入研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核屬于一種免疫相關(guān)性疾病，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降后導(dǎo)致感染加重，而免疫治療可通過改善患者機(jī)體免疫功能抵抗感染，效果顯著[8]。因此臨床上將肺結(jié)核的研究方向轉(zhuǎn)移至結(jié)合的免疫反應(yīng)中。結(jié)核免疫的重要組成部分為細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生長、分化，一方面殺滅結(jié)合分枝桿菌，另一方面啟動(dòng)負(fù)反饋調(diào)節(jié)限制過度的炎癥反應(yīng)給機(jī)體所帶來的損傷[9]。而有研究發(fā)現(xiàn)[10]，miR-16參與塵肺合并肺結(jié)核患者的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因而在血清呈高表達(dá)。

自1993年miRNA倍發(fā)現(xiàn)以來，大量新的miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人源性成熟的miRNA已有2500條以上。miRNA在真核生物中廣泛存在，其長度一般為18個(gè)核苷酸-25個(gè)核苷酸，屬于一種高度保守、非編碼的小分子單鏈RNA[11-12]。目前有較多的研究[13-14]已發(fā)現(xiàn)miRNA通過干擾、降解、抑制其靶基因的表達(dá)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理和病理過程，因而在免疫應(yīng)答中占據(jù)重要作用。顏保松等[15]在其研究中發(fā)現(xiàn)miR-101、miR-223、miR-424在肺結(jié)核患者外周血中的表達(dá)與健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)具有差異。楊紹俊等[16]在其研究中認(rèn)為肺結(jié)核患者血清中miR-155表達(dá)升高。另外賀晨艷等[17]在其研究中發(fā)現(xiàn)miR-146、miR-147參與肺結(jié)核的發(fā)展?；谏鲜鲅芯堪l(fā)現(xiàn)，血清中miRNA的表達(dá)與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-16家族包括miR-15b/16-1、miR-15b/16-2，其分別位于人12q14、3號(hào)染色體上，miR-16參與多種疾病的發(fā)生[18]。

Toll樣受體其定位于細(xì)胞膜中，當(dāng)其和細(xì)胞膜的受體產(chǎn)生結(jié)合作用后，胞內(nèi)下游的NF-κB會(huì)被活化，進(jìn)而刺激過量的炎癥因子的分泌，導(dǎo)致機(jī)體炎癥損傷。有研究認(rèn)為[19]，Toll樣受體屬于和天然免疫有密切關(guān)系的膜蛋白，且認(rèn)為TLR2、TLR4和免疫活化有關(guān)，并參與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等。目前已經(jīng)證實(shí)，TLRs信號(hào)通路和多種免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)。有研究表明[20]，肺結(jié)核患者細(xì)胞膜上的TLRs信號(hào)通路因子的異常表達(dá)可促進(jìn)疾病的進(jìn)展。TLRs屬于一種分岐桿菌感染的關(guān)鍵感受器，具有啟動(dòng)、協(xié)調(diào)抗分岐桿菌先天性免疫反應(yīng)過程的作用，在組織中為特異性的表達(dá)，TLRs在細(xì)胞類型、組織間的表達(dá)具有一定的差異性，在肺組織結(jié)構(gòu)中肺上皮細(xì)胞、肉芽中組織中的淋巴細(xì)胞中TLR2表達(dá)，在人外周血單核細(xì)胞中有TLR1、TLR2、TLR3表達(dá)等[21-22]。

表3 沉默miR-16對(duì)肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號(hào)通路因子的影響(±s，mg/L)Table 3 Effect of silencing microRNA-16 on TLRs signaling pathway factors in mice with pulmonary tuberculosis

表3 沉默miR-16對(duì)肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號(hào)通路因子的影響(±s，mg/L)Table 3 Effect of silencing microRNA-16 on TLRs signaling pathway factors in mice with pulmonary tuberculosis

注:與正常組比，*P＜0.05；與模型組比，＃P＜0.05；與過表達(dá)組比，△P＜0.05。Note.Compared with the control group，*P＜0.05.Compared with the model group，＃P＜0.05.Compared with the overexpression group，△P＜0.05.

組別Groups例數(shù)Number of cases TLR2 TLR4 NF-κB正常組Control group 10 2.35±0.24 2.36±0.16 2.39±0.42模型組Model group 8 4.89±1.23* 5.46±1.35* 4.98±1.72*過表達(dá)組Overexpression group 7 5.88±2.49*＃ 7.12±2.15*＃ 6.15±2.45*＃沉默組Silent group 8 3.63±1.04*＃△ 3.56±0.89*?！?3.45±0.98*＃△F 5.693 6.316 4.651 P 0.001 0.001 0.001

TLRs信號(hào)通路是目前臨床上認(rèn)為調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)的重要通路，而時(shí)廣利等[23]在其研究中發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者血清中miRNA-16表達(dá)升高，其研究推測miRNA-16可能參與肺結(jié)核的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此基于上述研究本文擬認(rèn)為，miRNA-16參與肺結(jié)核的應(yīng)答反應(yīng)的作用機(jī)制可能為TLRs信號(hào)通路。在本文研究中，研究沉默miRNA-16對(duì)肺結(jié)核模型小鼠TLRs信號(hào)通路因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，沉默miRNA-16后TLRs信號(hào)通路因子TLR2、TLR4、NFκB水平顯著降低，且肺組織中炎癥因子和免疫細(xì)胞因子水平均得到顯著改善，此結(jié)果說明，沉默miRNA-16改善肺結(jié)核小鼠免疫功能可能通過作用于TLRs信號(hào)通路，改善TLRs信號(hào)通路因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)浸提產(chǎn)生一系列的抗結(jié)核的保護(hù)免疫反應(yīng)，最終抑制結(jié)核的發(fā)展。

綜上所述，沉默miRNA-16可能通過作用于TLRs信號(hào)通路，抑制通路因子的異常表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，改善機(jī)體免疫障礙而起到調(diào)控肺結(jié)核小鼠免疫功能的作用。