趙 培，譚 鶴，彭克楠，李新新，馬 倩，霍麗靜，張明明，路永剛，帖彥清

(河北省人民醫(yī)院檢驗科，石家莊 050051)

PM2.5是指懸浮在大氣中空氣動力學直徑≤2.5μm的顆粒物，主要來源于燃料燃燒、機動車尾氣和道路揚塵等。石家莊市空氣污染嚴重，特別是PM2.5顆粒物重金屬含量高。研究發(fā)現(xiàn)PM2.5能避開呼吸系統(tǒng)屏障直接進入血液循環(huán)，改變白細胞功能，引起氧化應激和炎癥反應[1]。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，被認為是心血管疾病的主要病理學基礎(chǔ)[2]。多項流行病學研究顯示急性或長期暴露于PM2.5能顯著升高人群心血管事件發(fā)生和死亡的風險[3-4]。那么PM2.5能否引起ApoE-/-小鼠(As模型小鼠)血清及斑塊中炎癥因子及氧化應激的表達，改變小鼠心臟功能并加速動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展呢?本實驗采用PM2.5干預ApoE-/-小鼠(As模型小鼠)，通過超聲心動圖評價小鼠心臟功能；通過測定血清中以及降主動脈中的炎性因子水平來評價PM2.5對ApoE-/-小鼠的炎癥反應的影響；通過測定降主動脈中NAD(P)H氧化酶亞單位p22phox和p47phox的水平來評價PM2.5對ApoE-/-小鼠的氧化應激的影響。通過降支全動脈油紅O染色、主動脈根部MOVAT染色評估PM2.5干預對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的影響。本實驗就PM2.5暴露誘發(fā)ApoE-/-小鼠的炎癥反應和氧化應激從而促進其動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的深層機制進行初步探討，為積極應對PM2.5誘發(fā)心血管疾病的相關(guān)研究工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

32只八周齡的雄性SPF級ApoE-/-小鼠(體重為20～22 g)，購自卡文斯實驗動物有限公司[SCXK(蘇)2016-0010]，飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨床研究中心SPF級動物房，每籠5～6只。所有小鼠在20℃～24℃和45%～55%濕度條件下，以12 h的明暗循環(huán)用高脂飲食喂養(yǎng)8周(含21%脂肪、19.5%酪蛋白和1.25%膽固醇)，動物實驗在河北省人民醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(冀)2015-0065]進行，該動物實驗經(jīng)過了河北省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(201922)并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 實驗材料

細顆粒物(PM2.5)由河北省疾病預防控制中心通過TH-150D型智能中流量空氣總懸浮顆粒物采樣器進行24 h連續(xù)中流量采樣收集。收集PM2.5于內(nèi)置石英纖維濾膜上，每天更換一張濾膜，陰雨天氣不采樣。將PM2.5濾膜稱重并溶解于生理鹽水中，然后超聲波處理30 min，以分散顆粒，最后用液氮冷凍干燥，并在黑暗中4℃下儲存[5]。

1.2 主要試劑與儀器

藥品與試劑:高脂飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)；油紅O和MOVAT染液(Sigma Aldrich公司)；血糖、血脂(TC、TG、LDL-C)(貝克曼公司)；引物(英濰捷基貿(mào)易有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047 A，寶生物公司)，熒光定量檢測試劑盒(RR820 A，寶生物公司)。儀器:全自動生化分析儀(貝克曼5821)，石蠟切片機(德國Leica公司)，多用途低溫離心機(Eppendorf公司)，正置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)，體視顯微鏡(德國Leica公司)，Epoch CHS酶標儀(美國BioTek公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模處理

將ApoE-/-小鼠隨機分為PM2.5組(n＝16)和對照組(n＝16)，每天將10 mg的PM2.5粉末懸浮在4.8 mL的生理鹽水中，PM2.5組每只小鼠每天氣管滴注0.3 mL PM2.5混懸液一次，對照組滴注相同劑量的生理鹽水。小鼠PM2.5用量是參考石家莊地區(qū)正常成人每天PM2.5吸入量(2017年石家莊平均PM2.5為65μg/m3)，所有動物的操作均符合河北省人民醫(yī)院動物倫理委員會和NIH實驗動物護理和使用指南。

1.3.2 小鼠超聲心動圖和血流動力學測量

實驗結(jié)束時，小鼠經(jīng)1%的異氟醚麻醉后使用配有30 MHz高頻探頭的Visual Sonic Vevo 770型超聲儀(VisualSonics，Toronto，Canada)沿仰臥小鼠胸骨旁左室乳頭肌水平短軸和長軸切面采集左室圖像，同時在二維圖像引導下分別獲取5個以上連續(xù)心動周期M型超聲影像并記錄以下參數(shù):射血分數(shù)(LV ejection fractions，EF)，左室縮短分數(shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)，左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic dimension，LVESd)，左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDd)，左室舒張末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness at end diastolic stage，LVPWd)和左室舒張末期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness at end diastolic stage，LVAWd)，并比較兩組小鼠以上數(shù)據(jù)的差異。

1.3.3 小鼠全血重金屬測定

小鼠取血，采用質(zhì)量濃度為10 mg/L的鋁、釩、鐵、錳、硒、銀等微量重金屬(Agilent科技公司，美國)的標準溶液配制各種質(zhì)量濃度為0.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00和200.00μg/L的溶液，并建立標準曲線，電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS，Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA)測定全血的重金屬含量，同時測定小鼠所用的PM2.5混懸液的重金屬含量。

1.3.4 小鼠血糖、血脂、IL-6和TNF-α水平的測定

小鼠取血后離心獲得血清，全自動生化分析儀檢測血清葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的水平，ELISA方法測定血清IL-6和TNF-α水平。

1.3.5 小鼠動脈斑塊面積評估

評估整個動脈的脂質(zhì)沉積情況，從左鎖骨下動脈到髂骨分叉處解剖主動脈油紅O染色。以油紅O陽性面積/血管總面積×100%評估主動脈整體斑塊大小。主動脈根部行石蠟切片，參照文獻行Movat染色[6]，評估動脈斑塊大小，數(shù)據(jù)通過Image Pro PluS-6軟件(Media Cybernetics，Inc.)進行分析。

1.3.6 小鼠降主動脈斑塊內(nèi)部相關(guān)基因檢測

使用TRIzol兩步法抽提降主動脈的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書進行實時熒光定量PCR。20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應體系中，總RNA加樣量在約500 ng；得到的cDNA用無酶水稀釋5倍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。斑塊內(nèi)部相關(guān)因子及內(nèi)參基因熒光定量PCR反應引物序列，見表1。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)采用t檢驗或方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠超聲心動圖

定量分析表明，兩組間EF、FS、LVESd、LVEDd、LVPWD和LVAWD等數(shù)據(jù)差異無顯著性，PM2.5未能影響心臟功能(見圖1、表2)。

表1 基因引物序列Table 1 Realtime quantitative PCR gene primers

表2 對照組及PM2.5組ApoE-/-小鼠心臟功能的比較Table 2 Comparison of cardiac function between the control group and PM2.5 group

2.2 小鼠血液中重金屬含量測定

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定PM2.5混懸液及兩組小鼠血液中重金屬含量，我們發(fā)現(xiàn)PM2.5組(表3)全血中重金屬含量顯著升高，特別是鋁、釩和鐵，且PM2.5組小鼠的全血重金屬比例與PM2.5混懸液相似(表4)。這些數(shù)據(jù)表明PM2.5重金屬顆粒可以通過氣管滴注法進入ApoE-/-小鼠循環(huán)系統(tǒng)。

2.3 小鼠血糖、血脂以及促炎因子水平的檢測

PM2.5組和對照組小鼠血清的GLU、CHOL、TG、LDL-C和HDL-C水平無顯著差異(圖2A)。然而，經(jīng)PM2.5處理的ApoE-/-小鼠表現(xiàn)出較高的血清促炎因子(IL-6、TNF-α)表達水平(圖2B、2C)。

2.4 小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積評估

采用定量形態(tài)學方法測量了從主動脈弓到髂總動脈分叉處的全降主動脈油紅O染色標本，以代表動脈粥樣硬化斑塊所占區(qū)域。與對照組相比經(jīng)PM2.5處理的ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的百分比較高(*P＝0.0276)。主動脈根部切成5μm的石蠟切片進行Movat染色，顯示PM2.5組主動脈根部斑塊面積顯著增加(*P＝0.0231)，見圖3。

2.5 降主動脈斑塊內(nèi)部炎癥和氧化應激相關(guān)基因表達

我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)PM2.5處理后的ApoE-/-小鼠降主動脈斑塊內(nèi)經(jīng)典的促炎細胞因子IL-6、TNF-α、Lp-PLA2以及NAD(P)H氧化酶亞單位p22phox和p47phox的表達顯著增加(表5)。

注:A:對照組；B:PM2.5組。圖1 PM2.5對ApoE-/-小鼠超聲心動圖檢測的心功能影響Note.A，Control group.B，PM2.5 group.Figure 1 PM2.5 affect cardiac function tested by echocardiographic images in ApoE-/-mice

表3 PM2.5組小鼠及對照組小鼠血液中重金屬含量比較(μg/L)Table 3 Comparison of heavy metal content in blood of PM2.5 group mice and control group mice

表4 PM2.5混懸液重金屬的成份和含量(μg/L)Table 4 Composition and content of heavy metals in PM2.5 suspension

注:A:對照組和PM2.5組ApoE-/-小鼠血清炎癥因子水平差異無顯著性(P＞0.05)；B:PM2.5組ApoE-/-小鼠血清IL-6水平顯著升高(*P＜0.05)；C:PM2.5組ApoE-/-小鼠血清TNF-α水平顯著升高(*P＜0.05)。圖2 PM2.5處理對ApoE-/-小鼠血糖、血脂以及血清炎癥因子水平的影響Note.A，There was no significant difference in serum inflammatory factor levels between ApoE-/-mice in the control group and PM2.5 group(P＞0.05).B，Serum IL-6 level of ApoE-/-mice in PM2.5 group was significantly increased(*P＜0.05).C，Serum TNF-αlevel of ApoE-/-mice in PM2.5 group was significantly increased(*P＜0.05).Figure 2 The effect on serum glucose、serum lipids and serum inflammatory factor levels by treatment with PM2.5 in ApoE-/-mice.

注:A:對照組和PM2.5組全降主動脈油紅O染色；B:油紅O染色顯示PM2.5組全降主動脈斑塊面積顯著增加(*P＝0.0276)；C:PM2.5組和對照組主動脈根部切片MOVAT染色；D:MOVAT染色顯示PM2.5組主動脈根部斑塊面積顯著增加(*P＝0.0231)。圖3 PM2.5處理對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積的影響Note.A，descending aorta oil red O staining in the control group and PM2.5 group.B，oil red O staining showed a significant increase in the area of aortic plaques in the PM2.5 group(*P＝0.0276).C，MOVAT staining of aortic root sections in PM2.5 group and control group.D，MOVAT staining showed a significant increase in aortic root plaque area in the PM2.5 group(*P＝0.0231).Figure 3 The effect on areas of atherosclerotic lesions by treatment with PM2.5 in ApoE-/-mice

表5 PM2.5對ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)部炎癥反應和氧化應激的影響Table 5 The effect on inflammatory factors and Oxidative stress genes by treatment with PM2.5 in ApoE-/-mice

3 討論

2018年世衛(wèi)組織公布了最新的全球前十位死亡原因，其中缺血性心臟病和中風高居榜首，而As是這兩種疾病的主要病理基礎(chǔ)。As是一種在動脈管壁發(fā)生的慢性、低水平炎癥性疾病，以脂質(zhì)堆積和纖維斑塊形成為特征，血壓增高、血脂升高、慢性炎癥、氧化應激等因素都會引起As形成與惡化[7]。近年來關(guān)于大氣污染對As患者的不利影響逐漸引起了人們的重視。研究發(fā)現(xiàn)，短期暴露于高濃度或長期暴露于低濃度PM2.5是As進展的一個危險因素[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)PM2.5的暴露對超聲心動圖檢測的心功能沒有影響(P＞0.05)，同樣PM2.5組和對照組在血糖或血脂方面沒有顯著差異(P＞0.05)，說明短期(8周)暴露于高濃度的PM2.5可能不會對小鼠的心臟功能以及血糖和血脂的水平造成影響。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)LDL受體基因敲除小鼠長時間暴露于超細顆粒物會引起小鼠血漿中HDL水平降低，同時甘油三酯水平顯著升高。我們的研究結(jié)果與其不相同可能與本實驗PM2.5暴露時間短有關(guān)。

在病理條件下，持續(xù)或不受控制的炎癥可能導致宿主器官損傷和動脈粥樣硬化，導致心肌梗塞和中風[10-11]。氧化應激能夠通過直接氧化損傷和間接信號介導損傷促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[12]。而炎癥反應和氧化應激是PM2.5發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用的重要機制[13]。PM2.5經(jīng)呼吸進入肺部可直接造成呼吸道上皮氧化損傷和肺組織炎癥，導致大量炎性細胞因子進入體循環(huán)促發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應[14]。IL-6是由活化的巨噬細胞、上皮細胞以及平滑肌細胞等生成，能促進單核細胞趨化因子蛋白-1的分泌從而促進動脈粥樣硬化進程的發(fā)展，同時能增加細胞黏附分子的表達，刺激血管平滑肌細胞的增殖與遷移。動脈斑塊中存在著大量的巨噬細胞，這些巨噬細胞同樣能通過分泌促炎細胞因子(如IL-6、TNF-α等)吸收膽固醇、脂質(zhì)形成泡沫細胞，引發(fā)細胞凋亡等促進As斑塊的形成、發(fā)展和破裂[15]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)是新近發(fā)現(xiàn)的AS危險因子，它屬于磷脂酶A2超家族，由AS斑塊內(nèi)的巨噬細胞和淋巴細胞等合成，血漿中約有三分之二的Lp-PLA2與含apoB的LDL結(jié)合，并被轉(zhuǎn)運至血管內(nèi)膜的易損區(qū)，特異性地剪切內(nèi)膜下氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)分子中的氧化磷脂，生成促AS的炎性介質(zhì)-氧化型游離脂肪酸(OX-FA)和溶血卵磷脂(lyso-PC)[16]，這兩者能夠加快AS斑塊發(fā)生發(fā)展的進程、并促進斑塊的壞死和脫落。我們的研究發(fā)現(xiàn)PM2.5組ApoE-/-小鼠血清促炎因子(IL-6、TNF-α)水平顯著升高(P＜0.05)，這與國內(nèi)張書余等[17]的研究結(jié)果一致，他們的研究發(fā)現(xiàn)氣管滴入PM2.5懸浮溶液誘發(fā)了動脈粥樣硬化大鼠IL-6和TNF-α的表達增加；另有藥紅梅等[18]研究證實，PM2.5尾靜脈注射染毒可即使As大鼠血清IL-6，TNF-α，心肌NF-κB活性增加。除此之外我們的研究還發(fā)現(xiàn)PM2.5同時誘發(fā)了主動脈硬化斑塊內(nèi)IL-6、TNF-α及Lp-PLA2的表達升高(P＜0.05)，這可能是造成PM2.5組斑塊面積顯著增大的原因之一。

已經(jīng)證實活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成增多引起的氧化應激參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)是一類以生成ROS為主要功能的蛋白質(zhì)，NADPH氧化酶在單核細胞中生成ROS，是導致動脈粥樣硬化的重要因素[19]，目前共發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶有7種亞型，Nox2是最早發(fā)現(xiàn)的Nox亞型，Nox2表達于細胞膜，由胞膜亞基gp91phox、p22phox和胞漿亞基p40phox、p47phox、p67phox、Rac1組成，生理狀態(tài)下不具有活性，其活化需要胞漿亞基相互結(jié)合并轉(zhuǎn)位到細胞膜。越來越多的證據(jù)顯示，PM2.5能夠刺激機體產(chǎn)生氧化應激[20]，Mo等[21]研究發(fā)現(xiàn)PM2.5能夠通過p38和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)磷酸化，從而活化還原性輔酶II氧化酶(NADPH oxidase)引起內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS水平的升高，而血管內(nèi)皮的功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)之一。我們的研究發(fā)現(xiàn)，NAD(P)H氧化酶亞基p22phox和p47phox在PM2.5組ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的表達水平顯著升高(P＜0.05)。說明PM2.5激活了ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)NADPH氧化酶，NADPH氧化酶的激活或促使單核細胞和內(nèi)皮細胞中ROS的產(chǎn)生，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)PM2.5的暴露能夠引起ApoE-/-小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的升高，說明PM2.5促發(fā)了小鼠體內(nèi)的炎癥反應；我們還發(fā)現(xiàn)PM2.5組ApoE-/-小鼠動脈硬化斑塊發(fā)展速度明顯快于對照組，PM2.5組小鼠動脈斑塊內(nèi)IL-6、TNF-α、Lp-PLA2、NAD(P)H氧化酶亞基p22phox和p47phox表達顯著增加，這說明PM2.5能夠通過炎癥反應和氧化應激兩個方面加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。