邢煥微，葉 莉，李 昌，張素花，白杰英

(1.河北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津 300401；2.北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所非人靈長類動物研究中心，北京 100871；3.軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京 100071；4.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122)

干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins，IFITMs)是I型干擾素與配體結(jié)合誘導(dǎo)干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)表達(dá)的一系列活性蛋白，IFITMs會針對不同病原體ISGs進(jìn)行防御[1-2]。在人、山羊、牛、豬、小鼠等哺乳動物基因組中均發(fā)現(xiàn)有IFITMs基因家族成員存在，爬行類和魚類中也發(fā)現(xiàn)有IFITMs基因的表達(dá)。目前已發(fā)現(xiàn)的IFITMs基因包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM7和IFITM10等，其中人的IFITMs基因位于第11號染色體短臂對著端粒區(qū)26 kb處，小鼠的IFITMs基因位于7號染色體[3]，雞IFITMs基因集中在5號染色體，豬IFITMs基因存在于2號染色體。除IFITM10具有高保守性外，各物種間IFITMs基因在進(jìn)化上保留了種屬間序列差異性，但同一物種IFITMs基因簇均在同一染色體中；IFITMs蛋白大約含100～150個氨基酸。

非人靈長類動物IFITMs相關(guān)的研究，主要圍繞SIV或者HIV的感染控制開展。當(dāng)從非人靈長類動物細(xì)胞系中克隆到IFITMs基因時(shí)發(fā)現(xiàn)這些基因表達(dá)的蛋白與人類IFITMs具有相似的功能，能對HIV等一系列逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)在抑制作用[4]；非人靈長類動物IFITMs對SIV/HIV-1 viruses(SHIVs)具有抑制作用，而且，這種抑制作用具有膜蛋白識別特異性[5]。非人靈長類動物IFITMs的研究主要集中在其抗病毒作用方面，對非人靈長類動物IFITMs基因本身的遺傳進(jìn)化特點(diǎn)、表達(dá)特性、亞細(xì)胞定位等研究較少。而且，在諸多的IFITMs家族成員中，IFITM1、IFITM2和IFITM3被證明直接與機(jī)體免疫反映相關(guān)，其中IFITM3因其廣泛的病毒抑制作用而得到了更加深入的研究[6]。因此，本研究選擇IFITM3為代表，探討非洲綠猴IFITM3基因的表達(dá)與功能。

非洲綠猴是一種重要的非人靈長類模型動物，在模擬人類疾病的發(fā)生過程中，具有與人類組織器官病變和遺傳發(fā)育進(jìn)程相似的特點(diǎn)，因此受到生物醫(yī)學(xué)研究的廣泛青睞[7]，如應(yīng)用非洲綠猴開展?fàn)I養(yǎng)代謝方面的研究[8]；應(yīng)用非洲綠猴模型研究Nipah virus(NiV)感染，確定NiV氣溶膠感染的最適微粒大小等[9]。非洲綠猴因其健全的免疫系統(tǒng)和病毒適應(yīng)性，而被廣泛用于人獸共患感染性疾病的研究[10]，除艾滋病研究外，在神經(jīng)生物學(xué)、心腦血管疾病、病毒感染等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可作為穩(wěn)定的評價(jià)模型[11]。但對于非洲綠猴強(qiáng)悍的免疫適應(yīng)機(jī)制尚不明確，IFITMs是否也參與其中并起到重要作用尚不得而知。因此，本研究從非洲綠猴IFITMs基因的遺傳多樣性出發(fā)，探究其亞細(xì)胞定位，分析其與非洲綠猴抗感染免疫的關(guān)系，為揭示IFITMs蛋白家庭的抗病毒作用機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究使用非洲綠猴組織器官樣本獲贈于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心。所取樣本來自3只非洲綠猴(1只雌性，2只雄性)。級別:普通級，體重∶約5 kg，年齡∶4歲。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號[SCXK(軍)2017-0014]；實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號[SYXK(軍)2017-0022]。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動物中心“實(shí)驗(yàn)動物管理與使用委員會(IACUC)”和“實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員”審批，審批編號IACUC-2017-0018。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照福利倫理要求，符合實(shí)驗(yàn)動物3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

RNApure Tissue＆Cell Kit(CW0584S)、Universal Genomic DNA Kit(CW2298S)購自中國江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR037 A)、TaKaRa Ex Taq?(RR001 A)、TB Green?Premix Ex TaqTMII(RR820 A)購自日本寶日醫(yī)學(xué)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA marker(MD102-02)、質(zhì)粒提取試劑盒(DP118-02)、DNA凝膠回收試劑盒(DP209-03)均購自中國天根生化科技(北京)有限公司；Trans10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(CD101-01)購自中國全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA ligase(M1801)、pGEM-T Vector(A3600)購自美國Promega生物公司；兔源IFITM 3多克隆抗體(11714-1-AP)購自美國Proteintech Group公司。

PCR儀器選用BioRad T100TMThermal Cycler(美國BioRad公司)；熒光定量PCR儀采用BioRad CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System(美國BioRad公司)；紫外分光儀選用Thermo Scientific NanoDropTMOne超微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；顯微鏡選用Nikon ECLIPSE TS100(日本尼康株式會社)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的基因序列(XM_007986748.1，LOC103229029)設(shè)計(jì)IFITM3基因擴(kuò)增引物(見表1)，引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.3.2 總RNA、DNA提取與cDNA合成

將凍存的AGM心、肝、脾、肺、左腎、右腎、皮膚、大腦、淋巴結(jié)等組織用液氮研磨成粉末后，按照Universal Genomic DNA Kit(CW2298S)說明書提取組 織DNA，并按照RNApure Tissue＆Cell Kit(CW0584S)說明書提取組織總RNA，檢測所提核酸的完整性和純度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR037 A)說明書將得到的總RNA分離出mRNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為模板存于冰箱待用。

1.3.3 非洲綠猴IFITM3基因的克隆

用RT-PCR方法，從cDNA模板中克隆IFITM3基因。反應(yīng)條件:98℃3 min；98℃10 s，65℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。得到的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，按照DNA凝膠回收試劑盒(DP209-03)說明書純化目的片段，連接至pGEM-T Vector克隆載體后，轉(zhuǎn)入Trans10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞并涂布含氨芐抗性的固體LB培養(yǎng)基。經(jīng)過氨芐抗性篩選，挑取單克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)PCR鑒定后提取質(zhì)粒送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

1.3.4 Real-time PCR檢測

將1.3.2中取得的各組織cDNA按照TB Green?Premix Ex TaqTMII(RR820 A)說明書和表1中引物配制反應(yīng)體系，以人β-actin基因作內(nèi)參引物，每個樣本重復(fù)3次，在BioRad CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System中進(jìn)行兩步法PCR反應(yīng)。條件如下:95℃，變性30 s；95℃5 s，65℃退火30 s，共39個循環(huán)。反應(yīng)設(shè)置熔解曲線以觀測引物特異性擴(kuò)增情況，以0.5℃梯度從65℃加熱至95℃，每梯度1 s采集熒光數(shù)據(jù)制作曲線。將得到的Cq值以相對定量法計(jì)算，用Graphpad Prism 6軟件分析AGMIFITM3在各組織器官中的差異表達(dá)情況。

1.3.5 免疫組織化學(xué)方法檢測IFITM3蛋白的表達(dá)

取甲醛固定好的組織蠟塊，使用切片機(jī)切下厚度5μm的切片，用40℃溫水展片后置于防脫片載玻片并在烤片機(jī)中炙烤30 min。室溫下依次使用二甲苯、90%～70%酒精、蒸餾水、PBS液對組織切片脫蠟水化，配制抗原修復(fù)液并煮沸浸泡切片，甩干水分用3%過氧化氫滅活組織內(nèi)源酶。用山羊血清封閉液封閉非特異性位點(diǎn)，IFITM3多克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體作為二抗分別與組織切片反應(yīng)。清洗后滴加鏈霉菌抗生物素過氧化物酶溶液標(biāo)記，使用DAB溶液和蘇木素染色與復(fù)染，脫水處理后中性樹膠封片并在顯微鏡下觀察。

表1 非洲綠猴IFITM3基因擴(kuò)增用引物Table 1 Primers for cloning and quantification of IFITM3 transcripts in AGM

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用DNAMAN對所獲基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建立各物種間IFITM3基因的系統(tǒng)發(fā)育樹；使用TMHMM 2.0和CSS Palm 2.0軟件對IFITM3的氨基酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；用Graphpad Prism 6對Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行比較；用ImagePro Plus 6.0軟件對病理圖片進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和信號采集。

2 結(jié)果

2.1 非洲綠猴IFITM3基因的克隆

瓊脂糖電泳顯示，所克隆的IFITM3基因與目標(biāo)片段大小相符，見圖1；IFITM3的開放閱讀框(open reading frame，ORF)約為440 bp(圖1B)，而編碼框(code sequence，CDS)大約740 bp(圖1A)。

2.2 IFITM3基因序列分析

測序結(jié)果顯示，AGM-IFITM3 CDS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列一致，見圖2，大小為740 bp，包括兩個長度分別約為170 bp和130 bp的非編碼區(qū)以及一個441 bp的ORF。來源于AGM各組織器官的IFITM3 ORF序列比對顯示，各組織器官ORF序列存在核苷酸序列差異，見圖3。氨基酸序列分析顯示，第397位的胸腺嘧啶會造成精氨酸缺失外，其余組織IFITM3氨基酸與目標(biāo)氨基酸序列完全一致。

所獲得AGMIFITM3基因序列在進(jìn)化上與獼猴屬關(guān)系最近，同源性達(dá)到了93%，與靈長目動物(智人、大猩猩、黑猩猩等)屬于共同來源；而與鱷魚、斑馬魚等爬行綱和輻鰭魚綱動物基因進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，見圖4。

2.3 IFITM3的氨基酸序列分析

翻譯后的AGM IFITM3蛋白質(zhì)含有146個氨基酸，與人、豬、牛、鼠來源的IFITM3序列一致，見圖5。利用跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件TMHMM 2.0分析AGM IFITM3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)AGM的IFITM3蛋白同樣存在五個高度保守的特異性結(jié)構(gòu)域和CD225保護(hù)區(qū)，結(jié)合圖3可以看出AGM各組織IFITM3 ORF間的差異主要集中在NTD與CTD結(jié)構(gòu)域上CSS Palm 2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，AGM的IFITM3蛋白存在高度保守的泛素化、棕櫚?；稽c(diǎn)和YxxФ特異性結(jié)構(gòu)。

2.4 IFITM3的組織特異性表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，AGMIFITM3在脾、腎和皮膚中表達(dá)量較高，在腦中表達(dá)量最低，見圖6。免疫組化染色后，使用電子顯微鏡拍攝所觀察到的切片，腦、肺、肝等組織中IFITM3蛋白的陽性信號較弱，見圖7；用Image Pro Plus 6.0軟件對所有圖片進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和信號采集，結(jié)果顯示在脾淋巴細(xì)胞、腎小球和腎小管上皮細(xì)胞、腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞及皮脂腺細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量較多，信號較強(qiáng)，見表2。

3 討論

IFITMs是宿主細(xì)胞抵御病毒感染的第一道防線[12]，而IFITM3因?yàn)榫哂袕V泛的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能，近年來受到感染與免疫研究的廣泛關(guān)注。靈長目類人猿的IFITMs是猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus，SIV)的有效抑制劑，它甚至比人源IFITMs對HIV-1的抑制性更強(qiáng)[4]。用雙鏈非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染綠猴腎異倍體細(xì)胞可引起IFITMs的表達(dá)，以限制核周區(qū)內(nèi)吞途徑從而影響病毒進(jìn)入，IFITMs過表達(dá)能影響ASFV的脫殼作用[13]。

注:A:IFITM3 CDS區(qū)克隆電泳結(jié)果；B:IFITM3 ORF區(qū)克隆電泳結(jié)果。M:DNA marker；1:心臟；2:肝；3:脾；4:肺；5:左腎；6:右腎；7:皮膚；8:腦；9:淋巴結(jié)。圖1 不同組織器官IFITM3基因克隆電泳圖Note.A，Electrophoregram of IFITM3 CDS.B，Electrophoregram of IFITM3 ORF.M，DNA marker；1，Heart；2，Liver；3，Spleen；4，Lung；5，Left kidney；6，Right kidney；7，Skin；8，Brain；9，Lymph gland.Figure 1 Agarose electrophoresis of IFITM3 gene

圖2 AGM-IFITM3 CDS與目標(biāo)序列比對圖Figure 2 The alignment between AGM IFITM3 and target sequence

圖3 AGM各組織IFITM3 ORF比對Figure 3 The alignment of IFITM3 ORF in different organizations

注:Seq IFITM3為樣本序列。圖4 AGM IFITM3系統(tǒng)發(fā)育分析Note.Seq IFITM3 is the sample sequence.Figure 4 The alignment of IFITM3 ORF in different organizations

本研究克隆了非洲綠猴的IFITM3基因，發(fā)現(xiàn)其基因和蛋白序列與靈長目動物和哺乳動物具有高度相似性和同源性(圖2，3，4)，證明非洲綠猴IFITMs也會在機(jī)體的免疫保護(hù)過程中發(fā)揮作用。非洲綠猴的IFITM3同樣存在五個高度保守的特異性結(jié)構(gòu)域和CD225保護(hù)區(qū)。IFITMs家族的CD225結(jié)構(gòu)域是成員共享的一個高保守保護(hù)性區(qū)域，存在于內(nèi)膜TM1和胞CIL區(qū)，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诎l(fā)揮IFITMs的功能十分重要[14]。CSS Palm 2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，AGM的IFITM3蛋白存在高度保守的泛素化、棕櫚?；稽c(diǎn)和YxxФ特異性結(jié)構(gòu)(圖5)。這些特異性位點(diǎn)對于IFITM3的靶向輸送具有至關(guān)重要的作用。研究表明，IFITMs主要表達(dá)于細(xì)胞膜表面、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞內(nèi)囊泡等，其亞細(xì)胞定位與IFITMs的功能、類型及細(xì)胞種類相關(guān)[2，6]。在本研究中，IFITM3在非洲綠猴的心臟、肝、脾、肺、腎、皮膚、腦、淋巴結(jié)中均有表達(dá)，且其RNA在脾、腎和皮膚顯示出高豐度(圖6)，免疫組化結(jié)果與Real-time PCR相似，在脾淋巴細(xì)胞、腎小球和腎小管上皮細(xì)胞、腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞等組織器官中檢測到較強(qiáng)的IFITM3蛋白信號(圖7，表2)，該結(jié)果與張玉娟等[15]所研究的IFITMs在豬組織器官中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位相似。IFITMs是一種內(nèi)源基因，因此，如熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果所示，其基因和轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物RNA廣泛存在于非洲綠猴的各個組織器官中，但脾、腎和皮膚中的RNA豐度最高。通過轉(zhuǎn)錄后翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)，IFITM3蛋白質(zhì)則主要集中到非洲綠猴的免疫器官中，如脾、淋巴細(xì)胞、腎等(圖7)，這些組織器官在病原體入侵時(shí)發(fā)揮免疫功能，啟動機(jī)會的免疫響應(yīng)。本研究的結(jié)果顯示，存在于免疫器官的IFITM3蛋白含量明顯高于其他臟器，側(cè)面說明IFITM3作為機(jī)體重要的免疫防御武器的原因所在。

注:以心臟組織的PCR結(jié)果為對照組計(jì)算，**P＜0.01。圖6 各組織中IFITM3 Real-time PCR檢測結(jié)果Note.The PCR results of heart were used as the control group for calculation.**P＜0.01.Figure 6 AGM IFITM3 expression in different tissues by Real-time PCR

圖7 各組織染色后病理切片F(xiàn)igure 7 The image of Immunohistochemical section

表2 非洲綠猴各組織器官的IFITM3表達(dá)情況Table 2 Expression of IFITM3 in various tissues