鄢東海，向雪萍，逄永成，譚顯慶，鄭開恢，田 川，李自安，王 強(qiáng)，龐榮清*

(1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；2.巴東縣人民醫(yī)院，湖北 巴東 444300；3.巴東縣中醫(yī)醫(yī)院，湖北 巴東 444300)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs)易于取材、細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，具有免疫調(diào)節(jié)特性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛的細(xì)胞源，且在臨床可治療諸多疾病，這或許是細(xì)胞治療[1-2]新時(shí)代的開端。但是，植入細(xì)胞在體內(nèi)如何靶向遷移、定向分化等研究還不明確。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記是常用的體內(nèi)示蹤技術(shù)方法，用GFP標(biāo)記人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外分化成肝細(xì)胞[3]。胚胎期屬于個(gè)體發(fā)育的特殊時(shí)期，胚胎期注射hUMSCs能否向肝分化具有重要的意義，可為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所用動(dòng)物為SPF級SD大鼠。2只雄性SD大鼠和5只雌性SD大鼠，體重180～220 g，70～84 d日齡，均購于昆明醫(yī)科大學(xué)[SCXK(滇)K2015-0002]，飼養(yǎng)于第九二〇醫(yī)院屏障系統(tǒng)環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(軍)2017-0052]。經(jīng)第九二〇醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2017027)，使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)嚴(yán)格按照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)由第九二〇醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

新西蘭熱滅活小牛血清(商品貨號(hào)∶26170043)、DMEM/F-12培養(yǎng)基(商品貨號(hào)∶C11330500BT)和0.25%胰蛋白酶溶液(商品貨號(hào)∶252000-056)均購自美國Gibico公司；攜帶GFP基因的慢病毒購自吉滿生物公司(商品編號(hào)∶GM100101-2)；免疫組織化學(xué)染色用單抗Rabbitanti-human HNF4α(商品編號(hào)∶ab181604)、Rabbitanti-human HNF3β(商品編號(hào)∶ab180710)和Rabbitanti-human ALB(商品貨號(hào)∶ab2073227)均購自英國Abcam公司。Heal Force CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；IX 70-121倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus公司；正置熒光顯微鏡NIKON ECLIPSE C1、成像系統(tǒng)NIKON DS-U3均購自日本尼康公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 hUCMSCs的GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記

根據(jù)說明書并參照慢病毒轉(zhuǎn)染的技術(shù)方法[4]標(biāo)記hUCMSCs，即將鑒定合格的P3代hUCMSCs轉(zhuǎn)移到175 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)24 h后，按轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection MOI)MOI＝50的劑量在每瓶細(xì)胞中滴加攜帶GFP慢病毒液共培養(yǎng)72 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察，消化并收集標(biāo)記的細(xì)胞，即GFP-hUCMSCs用于傳代培養(yǎng)或懸浮于生理鹽水中制成1×107cells/mL的單細(xì)胞懸液避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SD大鼠胚胎注射GFP-hUCMSCs

按雄雌比1∶2和1∶3比例合籠，早、中、晚觀察雌鼠陰栓情況，發(fā)現(xiàn)陰栓計(jì)為孕齡0.5 d，并分籠精心喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)陰栓第15天時(shí)行胚胎注射。注射方法為切開孕鼠盆腔腹壁，暴露孕鼠“Y”字形雙子宮，無菌操作，保持胚胎濕潤，透過透明子宮壁給每只胎鼠上腹部快速注射0.1 mL含106個(gè)GFP-hUCMSCs。注射相同體積生理鹽水的同齡胎鼠作為陰性對照。注射完畢后，分層縫合切口，消毒后將孕鼠單獨(dú)放在有無菌敷料的鼠籠待其蘇醒，精心飼養(yǎng)觀察，待胎鼠出生后隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 肝組織冰凍切片GFP陽性細(xì)胞檢測

新生大鼠出生45 d、75 d、120 d時(shí)，手術(shù)切取少許肝組織。制作冰凍切片，滴加DAPI染色后直接在正置熒光顯微鏡觀察GFP陽性細(xì)胞的分布并拍照。

1.3.4 肝組織中人肝細(xì)胞特異蛋白免疫組織化學(xué)染色分析檢測

新生大鼠出生45 d、75 d、120 d時(shí)，隨機(jī)切取適量肝組織，迅速用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定后制石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化、抗原修復(fù)?？贵w孵育:一抗孵育(Rabbit-anti-human HNF4α、Rabbit-anti-human HNF3β和Rabbit-anti-human ALB)，在濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，PBS緩沖液(0.01 mol/L)漂洗3次；二抗孵育每張滴加抗兔生物素100μL，常溫孵育1 h，PBS緩沖液(0.01 mol/L)洗滌3次，每次3 min，每張滴加HRP標(biāo)記鏈親和素50μL，常溫孵育10 min。PBS緩沖液(0.01 mol/L)清洗3次，每次3 min，每張滴加DAB顯色液50μL，常溫孵育10 min，然后用自來水沖洗約10 min，蘇木素復(fù)染2 min，并加鹽酸酒精分化2 s，自來水洗凈染液。脫水、透明以及封片，最后用顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記hUCMSCs

按轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI＝50的劑量，將鑒定合格的P3代細(xì)胞與攜帶GFP慢病毒液共培養(yǎng)72 h。在熒光倒置顯微鏡下可清楚看到大量貼壁生長的細(xì)胞呈現(xiàn)較亮的綠色熒光信號(hào)(見圖1A)，未加入GFP慢病毒液共培養(yǎng)的對照組細(xì)胞觀察不到綠色熒光表達(dá)(見圖1B)。

2.2 各組肝中GFP陽性細(xì)胞的分布情況

胚胎期注射GFP-hUCMSCs的實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光信號(hào)的存在。其中，45 d較多，個(gè)別鼠特別多(圖2A、2B)，75 d減少(圖2C)，120 d只可見極少量熒光信號(hào)(圖2D)，對照組則觀察不到GFP陽性細(xì)胞分布(圖2E)。

注:A:與GFP慢病毒共培養(yǎng)的hUCMSCs；B:沒有共培養(yǎng)的對照hUCMSCs。圖1 轉(zhuǎn)染GFP基因標(biāo)記的hUCMSCsNote.A，hUCMSCs co-cultured with GFP lentivirus.B，Control hUCMSCs without co-culture.Figure 1 Transfection of GFP gene-tagged hUCMSCs

注:A:45 d組1只大鼠GFP陽性分布較多；B:45 d組大鼠GFP陽性分布；C:75 d大鼠GFP陽性分布；D:120 d GFP陽性分布；E:陰性對照組。圖2 不同組SD大鼠肝組織冰凍切片內(nèi)GFP信號(hào)觀察Note.A，The GFP positive distribution of 1 rat in the 45 d group was more.B，the positive distribution of GFP in the 45 d group.C，the positive distribution of GFP in the 75 d rat.D，120 d GFP positive distribution.E，Negative control group.Figure 2 Observation of GFP signal in frozen sections of liver tissue of SD rats in different groups

2.3 各組肝中人肝細(xì)胞相關(guān)蛋白的檢測情況

取各組大鼠肝組織制作石蠟切片，抗原修復(fù)，應(yīng)用免疫組化法，觀察人ALB、HNF4α和HNF3β蛋白表達(dá)情況顯示相關(guān)蛋白表達(dá)隨機(jī)分布，血管周圍有相對分布較多的趨勢。如圖∶實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織可檢測到人ALB(見圖3)、HNF4α(見圖4)和HNF3β(見圖5)蛋白的表達(dá)，對照組大鼠肝組織未檢測到這些蛋白的表達(dá)(見圖3、4、5D)。出生45 d大鼠肝內(nèi)ALB、HNF4α和HNF3β蛋白的表達(dá)量總體較多，出生75 d的表達(dá)量總體較少，出生120 d的表達(dá)極少、甚至檢測不到ALB、HNF4α和HNF3β蛋白的表達(dá)。同預(yù)期結(jié)果，對照組大鼠肝組織未檢測到這些人源蛋白的表達(dá)。如圖中箭頭所示，棕黃色或褐色為相關(guān)蛋白陽性表達(dá)。

3 討論

嵌合現(xiàn)象在自然界廣泛存在，而在早期胚胎中更為普遍。接受骨髓移植的患者體內(nèi)存在供受體來源細(xì)胞相互移居長期共存的嵌合現(xiàn)象[5-6]。胚胎期注射有助于嵌合體的形成和植入細(xì)胞的分化，國內(nèi)外科學(xué)家應(yīng)用胚胎注射法成功建立了人-綿羊造血干細(xì)胞嵌合體模型[7]和人-山羊肝嵌合體模型[8]。建立大型動(dòng)物嵌合體模型的操作復(fù)雜，設(shè)備要求較高，如何在生理?xiàng)l件下建立可靠易行的技術(shù)方法和動(dòng)物模型勢在必行。本研究首次探索運(yùn)用大鼠胚胎發(fā)育期免疫系統(tǒng)不成熟的自然條件，研究建立人-鼠嵌合體肝的可行性。

UCMSC在分化潛能[9-10]、免疫原性、來源、倫理問題等方面都有獨(dú)特的優(yōu)勢，已成為再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞。選擇hUCMSCs構(gòu)建模型，有利于hUCMSCs在治療人類疾病中的應(yīng)用，從而為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供更多理論支持。攜帶綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體液標(biāo)記細(xì)胞的方法追蹤細(xì)胞[3，11]在動(dòng)物體內(nèi)的分布簡便易行，GFP標(biāo)記高效、無毒副作用，時(shí)間較長，便于觀察，是一種良好的干細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)。組織制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下直接觀察綠色熒光信號(hào)的分布從而檢測植入已標(biāo)記細(xì)胞的分布。本實(shí)驗(yàn)用攜帶GFP的慢病毒載體液轉(zhuǎn)染標(biāo)記hUCMSCs(即GFP-hUCMSCs)，便于追蹤人源細(xì)胞在肝內(nèi)的分布。

注:A:45 d大鼠肝內(nèi)人ALB較多廣泛表達(dá)；B:75 d大鼠肝內(nèi)ALB零星較少表達(dá)；C:120 d大鼠肝內(nèi)人ALB微弱表達(dá)；D:陰性對照。紅色箭頭顯示ALB表達(dá)。圖3 不同組SD大鼠肝組織中人ALB蛋白免疫組織化學(xué)染色分析Note.A，45 d of intrahepatic human ALB is more widely expressed.B，75 d of intrahepatic ALB sporadic expression is less.C，120 d of intrahepatic ALB is weak Expression.D，Negative control.Red arrows show ALB expression.Figure 3 Immunohistochemical staining analysis of human ALB protein in liver tissues of SD rats of different groups

注:A:45 d大鼠肝內(nèi)人HNF3β的分布較多；B:大多75 d大鼠肝內(nèi)人HNF3β表達(dá)量較低；C:多數(shù)120 d大鼠肝內(nèi)檢測不到人HNF3β表達(dá)；D:陰性對照。紅色箭頭顯示HNF3β表達(dá)。圖5 不同組SD大鼠肝組織中人HNF3β蛋白免疫組織化學(xué)染色分析Note.A，The distribution of HNF3βin the liver of rats was more than 45 d.B，the expression of HNF3βin the liver of rats was lower in most of the 75 d.C，the liver of most 120 d human HNF3βexpression was not detected.D，Negative control.Red arrows show HNF3βexpression.Figure 5 Immunohistochemical staining analysis of human HNF3βprotein in liver tissues of SD rats of different groups

干細(xì)胞在動(dòng)物模型體內(nèi)存活和分化是模型成功與否的關(guān)鍵。冰凍切片發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中45 d綠色熒光信號(hào)較多，75 d的明顯減少，120 d時(shí)只可觀察到極少量熒光信號(hào)的存在；對照組肝組織中未檢測到綠色熒光信號(hào)。從而證明胚胎期注射的GFP-hUCMSCs可遷移到肝組織。肝富集轉(zhuǎn)錄因子(liver-enriched transcription factors)主要存在于肝并調(diào)控肝特異性基因的表達(dá)，在調(diào)控器官發(fā)育時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，促進(jìn)肝代謝[12]，其中HNF3β調(diào)控HNF4α等轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的許多基因的轉(zhuǎn)錄，而HNF4α屬二聚體轉(zhuǎn)錄因子，是一種鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，可控制多達(dá)60%的肝基因[13]，是肝特異性基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子。且HNF4α過表達(dá)的肝祖細(xì)胞可作為細(xì)胞移植的最佳候選者[14]。HNF4α在成熟肝細(xì)胞中的表達(dá)量最高，對肝細(xì)胞分化的調(diào)控、肝的形成和肝細(xì)胞生物學(xué)功能的維護(hù)都起重要作用，諸如肝癌等[14]許多肝疾病與HNF4α表達(dá)量的異常有關(guān)。白蛋白(ALB)主要存在于血漿中，大多在肝內(nèi)合成并分泌，常作為鑒定肝細(xì)胞功能正常與否的經(jīng)典指標(biāo)。采用免疫組化染色分析法，在出生45、75 d的實(shí)驗(yàn)組大鼠肝中可檢測到人HNF3β、HNF4α和ALB蛋白的表達(dá)，出生120 d的大鼠只能檢測到人源相關(guān)蛋白的微弱表達(dá)甚至完全檢測不到。從而證明植入細(xì)胞在大鼠肝體內(nèi)得到進(jìn)一步分化的機(jī)會(huì)。

綜上所述可知胚胎期注射GFP-hUCMSCs能夠遷移到胎鼠肝，在胎鼠出生后的肝內(nèi)存活并在至少45 d時(shí)間內(nèi)得到進(jìn)一步生長發(fā)育的機(jī)會(huì)，同時(shí)形成兩種來源細(xì)胞相互共存的嵌合狀態(tài)。但隨著大鼠出生時(shí)間的延長，人源細(xì)胞數(shù)量明顯減少，從側(cè)面說明人源細(xì)胞在兩種細(xì)胞生存競爭中很快處于不利地位，這可能與大鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和植入細(xì)胞的分化有關(guān)，但其具體的調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。