周玉平，呂雪幼，楊 萍 ，溫晉鋒，王慶領，葉國良

（寧波大學 1醫(yī)學院附屬醫(yī)院，2消化疾病研究所，浙江寧波315020；3寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，浙江寧波315100；4寧波大學醫(yī)學院，浙江寧波315211）

環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA研究領域的最新焦點之一，在闡明疾病發(fā)病機制及相關的診斷標志物及治療靶點方面，取得了重大進展［1］。本課題組通過基因芯片技術(shù)初步分析了肝纖維化模型小鼠肝臟的circRNA表達譜變化，顯示mmu_circ_42398的表達變化差異最大（模型組比正常組降低了11.74倍），此外，在小鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）活化模型中，mmu-circ-42398表達也顯著降低的［2］。本研究擬在此基礎上，圍繞肝星狀細胞活化這一肝纖維化最核心的細胞生物學事件，探討mmu_circ_42398對HSC活化的影響，并初步探討其可能的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制。

材料和方法

1 材料和主要試劑

JS1小鼠肝星狀細胞株購自深圳豪地華拓生物公司。胎牛血清和細胞培養(yǎng)液購自Gibco；TRIzol購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScript?Reverse Transcription Systemt和實時熒光定量PCR試劑盒GoTaq?qPCR Master Mix購自Promega；mmu_circ_42398過表達質(zhì)粒和對照空載質(zhì)粒由廣州吉賽生物科技公司提供；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所；Protease Inhibitor Cocktail和Phosphatase Inhibitor Cocktail購自Selleck。BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型膠原（collagen type I，Col I）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自Proteintech；轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3抗體購自Abcam。PCR及測序用小鼠引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2 實驗方法

2.1 JS1細胞培養(yǎng)和實驗分組 JS1細胞用10%FBS-DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至80%融合度傳代接種。細胞實驗時分成3組：正常對照組（control組）、空載體陰性對照組（vector組）和mmu_circ_42398過表達組（mmu_circ_42398組）。

2.2 過表達載體轉(zhuǎn)染JS1細胞 轉(zhuǎn)染前24 h，5×105個細胞接種在6孔板上，加入2 mL完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前細胞匯合達到70%～90%。在100 μL無血清培養(yǎng)液加入3 μg質(zhì)粒，柔和混勻。混勻Lipofectamine 2000試劑，用100 μL無血清培養(yǎng)液稀釋4 μL Lipofectamine 2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min。將稀釋好的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min。將200 μL質(zhì)粒-Lipofectamine 2000復合物加到含800 μL無血清培養(yǎng)液的細胞孔中，來回輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板。細胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～6 h后吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，更換完全培養(yǎng)液。48 h后收集細胞。

2.3 RT-qPCR驗證mmu_circ_42398過表達 提取細胞樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行qPCR檢測，分別以GAPDH和mmu_circ_42398特異引物進行qPCR。PCR擴增反應體系為20 μL，條件設置為：95℃ 10 min；95℃10 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。同時設計測序引物，PCR后回收條帶測序驗證環(huán)化位點接頭。每次設3個復孔，重復3次獨立實驗。

2.4 Western blot檢測蛋白表達 提取JS1細胞蛋白，BCA法定量，與SDS上樣緩沖液混合，95℃變性5 min。制膠，上樣，電泳，切膠，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜。PBST洗膜3次，每次10 min，以5%BSA/PBS封閉1 h，加I抗（α-SMA、Col I、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3及 GAPDH），4℃輕搖孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加II抗（1∶5 000稀釋），室溫輕搖孵育1 h。進行ECL化學發(fā)光顯影，獲取條帶后ImageJ軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照計算蛋白相對表達量。細胞實驗每次設3個復孔，重復3次獨立實驗。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 mmu_circ_42398過表達載體轉(zhuǎn)染效果觀察

細胞轉(zhuǎn)染48 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察，vector組和mmu_circ_42398過表達組見大部分JS1細胞內(nèi)有綠色熒光表達，兩組細胞形態(tài)無明顯異常，細胞轉(zhuǎn)染率達80%以上，見圖1。

Figure 1.The JS1 cell transfection rate 48 h after transfection（scale bar=200 μm）.Most of JS1 cells had green fluorescent protein expression.圖1 熒光顯微鏡觀察mmu_circ_42398過表達載體的轉(zhuǎn)染效果

2 mmu_circ_42398過表達效果驗證

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，mmu-circ-42398過表達組mmu_circ_42398的表達較vector組顯著增加（P＜0.01），見圖2A。將PCR產(chǎn)物進行一代測序，確定其環(huán)化位點（backsplice site），并將其序列信息與數(shù)據(jù)庫circBase中的序列信息對比，結(jié)果一致，見圖2B。這一結(jié)果證明該cicrRNA確實為環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)，而非線性RNA結(jié)構(gòu)。

Figure 2.Verification of mmu_circ_42398 over expression.A：mmu_circ_42398 expression in JS1 cells was detected by RT-qPCR；B：the backsplice site of PCR products was verified by sequencing，and compared with that of circBase database.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs vector group.圖2 mmu_circ_42398的鑒定及過表達效果的驗證

3 mmu_circ_42398過表達抑制JS1細胞的活化

Western blot結(jié)果顯示，mmu_circ_42398過表達組的α-SMA及Col I的蛋白表達較vector組顯著降低（P＜0.01），見圖3。

4 mmu_circ_42398過表達對TGF-β1/Smads信號通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與vector組比較，mmu_circ_42398過表達組的p-Smad2和p-Smad3蛋白水平顯著降低（P＜0.01），TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達量無顯著變化，見圖4。

討 論

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌、肝衰竭方向發(fā)展的共同病理階段，一直是肝病研究的重點領域。HSC的活化是促進肝纖維化持續(xù)發(fā)展的重要因素［3］，抑制HSC的活化被認為是抗肝纖維化的有效途徑［4］。TGF-β1/Smads信號通路在HSC的激活、組織纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關鍵性作用［5］。當TGF-β1與其位于HSC胞膜的受體（TGF-β1 receptor，TβR）結(jié)合并使TβR活化，與TβR結(jié)合的RSmads（包括Smad2和Smad3）就會被磷酸化而激活，Smad2/3是TβR-I受體的特異性信號轉(zhuǎn)導蛋白，磷酸化的R-Smads與Smad4形成多聚復合物，穿過核膜進入細胞核，在其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同下，參與不同目標基因的轉(zhuǎn)錄［6］，Smad7是該信號通路中最重要的負反饋調(diào)節(jié)蛋白［7］。調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路被認為是干預HSC活化和肝纖維化的重要策略。

circRNA是當前非編碼RNA研究領域的熱點，最近的兩項研究報道顯示，circRNA可能影響HSC的活化：Chen等［8］分析了放射線誘導的人肝星狀細胞株LX-2活化模型的circRNA差異表達譜，并進一步證實了hsa_circ_0071410可通過“miRNA海綿作用”結(jié)合miR-9-5p，從而影響HSC的活化；Wang等［9］的研究顯示患者血清CircMTO1表達水平與肝纖維化疾病進展顯著負相關，通過體外細胞模型進一步證實了CircMTO1可通過結(jié)合miR-17-5p，提高Smad7的表達水平，從而抑制肝纖維化進展。本課題組前期通過小鼠肝纖維化模型和肝細胞株JS1體外活化模型，篩選出mmu_circ_42398可能影響肝星狀細胞的活化。本研究通過構(gòu)建mmu_circ_42398過表達質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到JS1細胞中，觀察到星狀細胞活化標志物即α-SMA及Col I蛋白表達顯著減少，說明mmu_circ_42398過表達能顯著抑制HSC的活化。課題組進一步從TGF-β1/Smads信號通路的角度探討了其可能的機制，結(jié)果顯示，mmu_circ_42398過表達組JS1細胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白水平顯著降低，但TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達量無顯著變化。上述結(jié)果提示，mmu_circ_42398過表達能顯著抑制R-Smads的磷酸化，從而抑制細胞內(nèi)TGF-β1/Smads信號通路的轉(zhuǎn)導，這是其抑制HSC活化的作用機制之一。

此前，我們通過生物信息學分析，顯示mmu_circ_42398表面存在miR-338-3p的反應元件（microRNA response element，MRE），能特異性結(jié)合miR-338-3p［10］。最近的一項雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烇@示miR-338-3p能直接與骨成形蛋白-激活素膜結(jié)合阻斷因子（BMP and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI）結(jié)合，降低 BAMBI活性，從而激活TGF-β/Smads信號通路［11］。BAMBI是 TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導通路的偽受體，與TGF-βⅠ型受體結(jié)構(gòu)相似，但不具有同樣的活性，它可以競爭性地與TGF-βⅡ型受體結(jié)合，BAMBI由于缺乏胞內(nèi)區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域而不能磷酸化，導致胞質(zhì)區(qū)的Smad蛋白無法被磷酸化激活，從而阻斷TGF-β家族的信號轉(zhuǎn)導［12］。本實驗觀察到，mmu_circ_42398的過表達對TGF-β1本身表達并無影響，僅是降低了Smads蛋白的磷酸化水平，上述結(jié)果提示，mmu_circ_42398可能通過“miRNA海綿作用”靶向結(jié)合miR-338-3p，提高了BAMBI表達水平，從而進一步抑制Smads蛋白的磷酸化水平，最終抑制了HSC的活化。