宋志明，余舒杰，焦 潔，楊美玲，李平平，李方敏，錢孝賢△

（1河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南開封475001；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州510630）

最新發(fā)布的《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》顯示，心血管疾病仍是我國(guó)城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位因素，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤等其它疾病。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┰?002～2016年仍呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，僅2017年大陸地區(qū)冠心病介入治療總數(shù)就超過了75萬(wàn)例，給患者家庭、社會(huì)以及國(guó)家社保帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是公認(rèn)的冠心病發(fā)生的始動(dòng)因素，更是其發(fā)展的主要促動(dòng)因素［2］。研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，冠心病發(fā)病率也逐漸增加，證實(shí)了與增齡相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老促進(jìn)了血管事件的發(fā)生。因此，如何逆轉(zhuǎn)或減輕內(nèi)皮細(xì)胞衰老成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)臨床難點(diǎn)，也成為冠心病防治的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼CO和NO后在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)氣體信號(hào)分子。新近的大量研究也已證實(shí)了它在維持心血管系統(tǒng)功能中發(fā)揮了重要作用［3-4］。本研究旨在觀察外源性H2S對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的作用，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

H2O2、MTT、NaHS和DMSO購(gòu)自Sigma-Aldrich；Ⅰ型膠原酶購(gòu)自Invitrogen；無(wú)血清培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）、M199培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Gibco；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑購(gòu)自BD；預(yù)染蛋白條帶標(biāo)志物購(gòu)自Fermentas；抗Akt抗體、抗磷酸化Akt（p-Akt）抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；抗血漿纖溶酶原激活物抑制劑1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）抗體購(gòu)自 Santa Cruz；抗GAPDH內(nèi)參照抗體購(gòu)自Proteintech；抗小鼠及兔Ⅱ抗購(gòu)自武漢博士德；衰老染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液和蛋白定量（BCA法）試劑盒購(gòu)自南京凱基。

2 方法

2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng) 本研究采用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其分離培養(yǎng)參見既往文獻(xiàn)報(bào)道［4-5］。若無(wú)特殊交代，研究所用細(xì)胞均為1～3代。本研究經(jīng)河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合Helsinki原則。相差倒置顯微鏡下，HUVECs貼壁單層生長(zhǎng)，呈短梭狀或鋪路石樣排列，細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞漿豐富。本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離培養(yǎng)的第1代內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志分子CD31進(jìn)行了流式細(xì)胞法測(cè)定。結(jié)果顯示，細(xì)胞CD31陽(yáng)性率為99.9%。

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型的建立 內(nèi)皮細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長(zhǎng)至70%時(shí)，加入60 μmol/L的H2O2培養(yǎng)1 h［6］，此后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。通過衰老相關(guān)β半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase staining，SA-β-Gal）染色和衰老標(biāo)志物PAI-1的檢測(cè)判斷模型成功與否。衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色參照既往方法進(jìn)行［6］。PAI-1的檢測(cè)方法參見Western blot部分。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 蛋白提取過程參照既往研究［4］，每孔加 50～60 μL 細(xì)胞裂解液，放于冰上孵育15 min，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，13 200 r/min、4oC離心15 min；吸取上清，分裝保存于-80oC冰箱備用。蛋白經(jīng)BCA定量，總蛋白進(jìn)行SDSPAGE，轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，加入相應(yīng)抗體，4oC搖床上過夜孵育；棄去Ⅰ抗，1×TBST洗3次，加入抗小鼠或兔Ⅱ抗，室溫孵育1 h后，TBST洗3次，ECL顯影，最后用Quantity One軟件分析蛋白條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 H2O2誘導(dǎo)的HUVECs衰老模型

內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)，加入60 μmol/L的H2O2培養(yǎng)1 h，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比H2O2組的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)扁平，PAI-1蛋白表達(dá)大幅度增加，SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞增加（P＜0.05），見圖1。

2 NaHS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L NaHS能夠明顯延緩高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老［4-5］。因此，在本課題中我們繼續(xù)選用100 μmol/L NaHS進(jìn)行研究。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)給予NaHS預(yù)處理1 h，之后再用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H2O2組相比，NaHS組PAI-1的表達(dá)明顯降低，SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞的比例也顯著減少（P＜0.05），見圖2。

3 NaHS對(duì)于衰老內(nèi)皮細(xì)胞Akt磷酸化的影響

細(xì)胞衰老的過程是借由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，而且不只是一種途徑，其中Akt起到了重要作用。因此，我們對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞衰老誘導(dǎo)過程中不同時(shí)點(diǎn)Akt的活性進(jìn)行了檢測(cè)。Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，Akt的磷酸化水平在衰老誘導(dǎo)過程中較基礎(chǔ)水平持續(xù)升高，其中H2O2處理3 h后的磷酸化水平最高，見圖3。

Figure 1.Premature senescence was induced by H2O2（60 μmol/L）treatment.A：the results of Western blot for determining protein level of PAI-1；B：the ratio of SA-β-Gal positive cells was calculated on 400 cells per group.Senescent cells were stained with blue color（×100）.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group.圖1 H2O2誘導(dǎo)的早熟型衰老模型鑒定

Figure 2.The effect of NaHS（100 μmol/L）on H2O2（60 μmol/L）-induced senescence in HUVECs.A：the results of Western blot for determining the protein levels of PAI-1；B：the ratio of SA-β-Gal positive cells was calculated on 400 cells per group（×100）.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H2O2group.圖2 NaHS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

我們進(jìn)一步采用NaHS預(yù)處理1 h、H2O2處理3 h的細(xì)胞模型來(lái)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞Akt的磷酸化水平，從而探究NaHS是否通過調(diào)節(jié)Akt活性而減輕內(nèi)皮細(xì)胞衰老，結(jié)果提示，NaHS能夠降低H2O2誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平，見圖3。

4 抑制Akt磷酸化對(duì)于H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

為明確Akt磷酸化在H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用，我們運(yùn)用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002進(jìn)行研究。首先，我們檢測(cè)不同濃度的LY294002及H2O2處理細(xì)胞3 h后Akt磷酸化程度，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L、30 μmol/L及50 μmol/L LY294002均可明顯抑制Akt磷酸化，見圖4A。此后的研究我們選用 30 μmol/L LY294002 濃度。與 H2O2組比較，30 μmol/L LY294002組SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著下降，PAI-1蛋白表達(dá)明顯減 少（P＜0.05），見圖4。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)在H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老中，Akt活性較基礎(chǔ)水平持續(xù)升高；而NaHS能夠通過抑制Akt的活化而部分延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

Figure 3.The phosphorylation of Akt treated with H2O2（60 μmol/L ）in different time points or pretreatment of NaHS（100 μmol/L）in HUVECs.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H2O2group.圖3 內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中Akt磷酸化水平變化及NaHS對(duì)其的影響

Figure 4.The effect of LY294002 on senescence in HUVECs.A：dose-dependent inhibition of Akt activation by LY294002；B：the ratio of SA-β-Gal positive cells was calculated on 400 cells per group（（×100）；C：the results of Western blot for determining the protein levels of PAI-1 and normalized analysis of the intensity.Mean±SD.n=3～4.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H2O2group.圖4 LY294002對(duì)H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響

越來(lái)越多的研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞衰老是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的重要因素，它啟動(dòng)并參與了其發(fā)生和發(fā)展整個(gè)過程［7］。首先，衰老細(xì)胞通過分泌相關(guān)細(xì)胞因子和表面受體介導(dǎo)單核細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞壁從而促發(fā)斑塊形成；衰老的內(nèi)皮細(xì)胞更傾向于凋亡，導(dǎo)致內(nèi)膜功能受損，這樣氧化性低密度脂蛋白就能進(jìn)入血管壁。然后，衰老細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如單核細(xì)胞趨化因子和白細(xì)胞介素參與斑塊的進(jìn)展。最后，衰老細(xì)胞誘發(fā)斑塊的不穩(wěn)定或形成易損斑塊，從而造成急性心血管事件的發(fā)生。

內(nèi)皮細(xì)胞衰老分為復(fù)制性衰老和早熟型衰老。許多的刺激因素，如過氧化氫、高糖、高脂等均可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞早熟型衰老［4-6］。本研究中采用60 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，模型成熟、穩(wěn)定［6］。同時(shí)，運(yùn)用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，更貼近人體生理環(huán)境。

蛋白激酶B，又稱為Akt，在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。Akt增加細(xì)胞活性氧簇的產(chǎn)生，同時(shí)抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的清除，進(jìn)而促進(jìn)或加速?gòu)?fù)制性及早熟型衰老。內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究中，降低Akt磷酸化能夠通過P53/P21途徑延長(zhǎng)細(xì)胞壽命［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，12周高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠血管衰老，而這與持續(xù)活化的Akt有關(guān)，而Akt基因敲除的小鼠血管衰老程度明顯減輕［9］。在另外的研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中Akt活性增高，但是進(jìn)一步提高其活性也能夠延緩衰老，考慮其能增強(qiáng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶活性有關(guān)［10］。與此前研究結(jié)果一致，我們的研究也發(fā)現(xiàn)在H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老過程中，Akt的活性較基礎(chǔ)水平持續(xù)升高，而應(yīng)用LY294002預(yù)處理特異性抑制Akt活性能延緩細(xì)胞衰老。

H2S是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。在我們前期的研究中已經(jīng)證實(shí)，它能夠延緩高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老［4-5］。已有研究報(bào)道提示外源性H2S通過Sirt1通路部分逆轉(zhuǎn)過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老［11］。本研究證實(shí)H2S可以抑制Akt的活化，延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

本研究結(jié)果提示，H2S能通過抑制Akt活化，部分性抵抗H2O2誘導(dǎo)的HUVECs衰老。Akt活性的調(diào)節(jié)或許可成為防治年齡相關(guān)性心血管疾病的治療靶點(diǎn)。