黃華坤，袁曉慧，張 平，喻婷婷，張露露，楊春梅，羅小輯，羅進(jìn)勇△

（1重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶400016）

骨肉瘤是最常見(jiàn)的惡性原發(fā)性骨腫瘤［1］，其具有較高的局部侵襲和早期轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)［2］。目前，治療骨肉瘤的方法主要是化療［3］和放療［4］，但是無(wú)論是放療還是化療都有患者承受不起的巨大副作用。鑒于此，臨床上急需容易獲取、療效好而藥物毒副作用低的新型藥物用于骨肉瘤的輔助治療。

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，AG）是從穿心蓮植物中提取出來(lái)，具有多種藥理活性，相關(guān)文獻(xiàn)研究了穿心蓮內(nèi)酯治療人類(lèi)癌癥和免疫細(xì)胞的細(xì)胞過(guò)程和調(diào)控靶點(diǎn)［5］。隨著對(duì)穿心蓮內(nèi)酯研究的深入，發(fā)現(xiàn)其還有抗炎［6-8］、抗病毒［9-10］、抗腫瘤和保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用［11-12］。文獻(xiàn)研究表明，穿心蓮內(nèi)酯可以很好地抑制膀胱癌［13］、前列腺癌［14］、口腔癌［15］、胃癌［16］、結(jié)腸癌［17］、乳腺癌［18］等多種腫瘤，且抗腫瘤作用效果好，毒副作用較小。然而，目前穿心蓮內(nèi)酯在骨肉瘤方面的研究還比較少。本研究旨在討論穿心蓮內(nèi)酯對(duì)人骨肉瘤143B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等方面的抑制作用及促凋亡作用，再深入探討其潛在的分子機(jī)制，為臨床上骨肉瘤的治療提供一個(gè)新的方向。

材料和方法

1 細(xì)胞株與主要試劑

骨肉瘤143B細(xì)胞（重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆茫ＬヅＱ澹╢etal bovine serum，F(xiàn)BS；ExCell Bio）；DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone）；穿心蓮內(nèi)酯（成都瑞芬思生物科技有限公司）；MTT（Sigma）；青霉素+鏈霉素和Lipofectamine 2000（Thermo Scientific）；Hoechst 33258 染液（Solarbio）；結(jié)晶紫染液、蛋白提取試劑盒及Western blot相關(guān)試劑（上海碧云天公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO；BioFrox）；孔徑為8 μm的Transwell小室（Corning）；基質(zhì)膠（BD Biosciences）；熒光素酶檢測(cè)試劑盒（New England Biolabs）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜和化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore）；鼠抗人Snail及Bcl-2單克隆抗體，兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、波形蛋白（vimentin）、β-catenin和c-Myc單克隆抗體，兔抗人cleaved caspase-3和caspase-3多克隆抗體（CST）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（鐘鼎生物）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（II抗；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞用含5 mL青霉素+鏈霉素配制成的10%DMEM高糖培養(yǎng)液（10%FBS），置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，即可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)143B細(xì)胞總數(shù) 當(dāng)143B細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將10 μL的細(xì)胞懸液打進(jìn)牛鮑計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)。向24孔板中的每個(gè)孔加入500 μL含4×104個(gè)細(xì)胞的10%FBS。待細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)，將細(xì)胞分為溶劑DMSO對(duì)照（control）組及0、5、10、15和20 μmol/L AG（用DMSO溶解成40 mmol/L的儲(chǔ)存液）處理組，每個(gè)濃度均有3個(gè)復(fù)孔。分別在A(yíng)G處理后的24、48和72 h后，取出相應(yīng)時(shí)間的24孔板，用PBS洗滌2次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，在暗處將結(jié)晶紫染料加入到每個(gè)孔中（結(jié)晶紫染料以覆蓋住孔底為宜），避光染色10 min，用水沖洗剩余的結(jié)晶紫染料，干燥后掃描儀掃描孔板。然后向每個(gè)孔加入10%的冰乙酸500 μL，并在震蕩儀上室溫適當(dāng)震蕩10 min，以便結(jié)晶紫充分溶解，并使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570 nm處各孔的吸光度（A）。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率（%）=（control組A值-處理組A值）/control組A值×100%。

2.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)143B細(xì)胞的活力 當(dāng)143B細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將10 μL的細(xì)胞懸液打進(jìn)牛鮑計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)。向96孔板中的每個(gè)孔加入200 μL含4 000個(gè)細(xì)胞的10%FBS。待細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)，按2.2所述分組，每個(gè)濃度均有2個(gè)復(fù)孔。分別在A(yíng)G處理后的0、24和48 h后，取出相應(yīng)時(shí)間的96孔板，往每個(gè)孔加入10 μL MTT溶液，放置37℃培養(yǎng)箱4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，室溫避光適當(dāng)震蕩10 min，然后使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的A值，并繪制細(xì)胞活力圖。重復(fù)3次此實(shí)驗(yàn)。

2.4 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)143B細(xì)胞的集落形成能力 當(dāng)143B細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將10 μL的細(xì)胞懸液打進(jìn)牛鮑計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)。每孔1 000個(gè)接種于6孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞分為control組及 0、1.875、2.5、3.125和3.75 μmol/L AG處理組。在37℃孵箱中培養(yǎng)7 d，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，在暗處將結(jié)晶紫染料加入到每個(gè)孔中（結(jié)晶紫染料以覆蓋住孔底為宜），避光染色10 min，用水沖洗剩余的結(jié)晶紫染料，干燥后掃描儀掃描孔板。鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落為有效細(xì)胞集落。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)3次。集落形成率（%）=有效細(xì)胞集落數(shù)/總細(xì)胞集落數(shù)100%。

2.5 細(xì)胞Hoechst 33258染色檢測(cè)143B細(xì)胞凋亡水平 當(dāng)143B細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將10 μL的細(xì)胞懸液打進(jìn)牛鮑計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)。向24孔板中的每個(gè)孔加入500 μL含4×104個(gè)細(xì)胞的10%FBS。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合度到50%的時(shí)候，按2.2所述分組，分別處理細(xì)胞24 h，每個(gè)濃度均有3個(gè)復(fù)孔。待處理時(shí)間結(jié)束后，取出24孔板，棄去培養(yǎng)基后用PBS洗滌兩次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，每孔加入0.01 g/L的Hoechst 33258染液300 μL，避光靜止10 min，棄去染液。在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察到細(xì)胞核形態(tài)及大小出現(xiàn)明顯改變時(shí)，對(duì)每個(gè)視野的凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。重復(fù)此實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)143B細(xì)胞凋亡水平 當(dāng)143B細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞加入到6 cm培養(yǎng)皿中，待待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合度到50%的時(shí)候，按2.2所述分組，分別處理細(xì)胞24 h，每個(gè)濃度均有3個(gè)復(fù)孔。待處理時(shí)間結(jié)束后，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，800 r/min離心3 min。棄上清，PBS洗滌，重復(fù)3次，最后一次用500 mL PBS重懸細(xì)胞。具體操作方法按照annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡情況。

2.7 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)143B細(xì)胞的遷移能力 當(dāng)143B細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將10 μL的細(xì)胞懸液打進(jìn)牛鮑計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)。向6孔板中每個(gè)孔加入2 mL含有1×105個(gè)細(xì)胞的10%FBS，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)孔板后，按2.2所述分組并分別處理細(xì)胞，并且在處理后的0、18和36 h分別記錄相對(duì)應(yīng)點(diǎn)上同一位置的劃痕區(qū)域的寬度來(lái)反應(yīng)AG對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞遷移能力的影響。劃痕愈合率（%）＝（0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

2.8 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)143B細(xì)胞的侵襲能力 基質(zhì)膠原液用DMEM稀釋20倍，將Transwell小室放置于24孔板中，往Transwell小室上室加入60 μL稀釋20倍的基質(zhì)膠。放入37℃孵育箱中，待基質(zhì)膠凝固后，棄去小室中剩余的液態(tài)培養(yǎng)基。取融合度達(dá)80%～90%的143B細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞（在鏡下觀(guān)察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓時(shí)，即終止消化），然后用10%FBS重懸細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。將10 μL的細(xì)胞懸液打進(jìn)牛鮑計(jì)數(shù)板中，顯微鏡下計(jì)數(shù)。并向每個(gè)小室的上室加入400 μL含2.5×105個(gè)細(xì)胞的DMEM，按2.2所述分組并分別處理細(xì)胞，然后在下室加入500 μL 10%FBS，37℃孵育箱培養(yǎng)24 h。24 h后取出Transwell小室，棄去剩余的培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，然后用4%的多聚甲醛37℃孵育箱中固定20 min，棄去多聚甲醛，用棉簽擦掉上室中未穿透小室膜的細(xì)胞。在暗處用結(jié)晶紫染料染色，避光染色10 min，用水沖洗剩余的結(jié)晶紫染料。干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照，顯微鏡下取3個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.9 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 取細(xì)胞融合度達(dá)50%的143B細(xì)胞，按2.2所述分組并分別處理細(xì)胞，24 h后分別提取總蛋白，用BCA法測(cè)定各組蛋白濃度，分別加入蛋白上樣緩沖液后（蛋白量與緩沖液比值為4∶1），于沸水中煮10 min使蛋白變性，-80℃儲(chǔ)存。將適量蛋白樣品加入到10%SDSPAGE，恒壓濃縮和分離蛋白，恒流（210 mA）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%BSA封閉液在37℃封閉3 h，然后加入相對(duì)應(yīng)的I抗（1∶1 000稀釋?zhuān)┯?℃放置12～16 h。在震蕩儀上用TBST洗膜3次，每次10 min。然后加入相對(duì)應(yīng)的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG II抗（1∶5 000稀釋?zhuān)┯?7℃孵育1 h，再用TBST洗膜3次，每次10 min，用化學(xué)發(fā)光成像儀成像。顯色結(jié)果用Image Lab軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次后，用GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)差異采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AG對(duì)143B細(xì)胞增殖的抑制

結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，143B細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)不同濃度（5、10、15、20）μmol/L AG處理24、48和72 h后，與空白組相比，細(xì)胞總數(shù)出現(xiàn)濃度依賴(lài)性下降。（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。隨后，我們使用低濃度AG（0 μmol/L、1.875 μmol/L、2.5 μmol/L、3.125 μmol/L和3.73 μmol/L）處理143B細(xì)胞，經(jīng)過(guò)7 d的培養(yǎng)，與空白組相比，隨著AG濃度增加，143B細(xì)胞集落形成數(shù)目明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果所示，與空白組相比，經(jīng)過(guò)AG處理48 h后，15 μmol/L和20 μmol/L AG處理組中143B細(xì)胞的活力明顯受到抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖1C。Western blot結(jié)果同樣顯示，143B細(xì)胞經(jīng)過(guò)AG各組處理后，AG可下調(diào)143B細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA的水平（P＜0.01），見(jiàn)圖1D。由此表明AG可抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖，且這種抑制效果呈濃度依賴(lài)性。

2 穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258染色結(jié)果所示。143B細(xì)胞經(jīng)過(guò)AG各組處理后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，其中空白組細(xì)胞凋亡率為（2.45±0.80）%，20 μmol/L AG處理組凋亡率為（68.33±1.51）%，處理組較空白組凋亡率顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所示，143B細(xì)胞經(jīng)過(guò)AG各組處理后，各處理組與空白對(duì)照組的早期和晚期凋亡率差異明顯，特別是10 μmol/L、15 μmol/L和20 μmol/L AG 處理組（均P＜0.01），見(jiàn)圖2B。Western blot結(jié)果同樣顯示，143B細(xì)胞經(jīng)過(guò)AG各組處理后，AG可下調(diào)143B細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的水平（P＜0.05）、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的水平（P＜0.05），凋亡相關(guān)蛋白總 caspase-3和PARP下降，而剪切的caspase-3（c-caspase-3）和剪切的PARP（c-PARP）蛋白水平上升（P＜0.01），見(jiàn)圖2C。以上結(jié)果均表明AG可以誘導(dǎo)143B細(xì)胞凋亡。

3 AG抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的遷移及其侵襲能力

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)20 μmol/L AG處理36 h后，143B細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制，愈合率僅為（36.43±2.57）%，而與空白組0 h（左上）相比，36 h后空白組（左下）的細(xì)胞劃痕愈合率高達(dá)（87.26±2.21）%，處理組較空白組遷移能力顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。隨后，我們使用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AG對(duì)143B細(xì)胞侵襲能力的影響，經(jīng)過(guò)24 h處理后，空白組中穿透小室的143B細(xì)胞數(shù)量為（405±5）個(gè)，而20 μmol/L AG處理組中，穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)為（112±6）個(gè)，數(shù)量明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。Western blot結(jié)果同樣顯示，遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-9、vimentin和Snail的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。以上結(jié)果均表明經(jīng)AG處理，143B細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著受到抑制。

4 AG抑制骨肉瘤143B細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路的激活是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，鑒于此，本研究使用Western blot檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中的β-catenin及其下游靶分子c-Myc的表達(dá)量。結(jié)果顯示，15 μmol/L和20 μmol/L AG處理組與空白組相比，143B細(xì)胞中β-catenin和c-Myc的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖4。由此提示AG可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖和侵襲，并促其凋亡。

討 論

骨肉瘤是一種多發(fā)于青少年兒童的原發(fā)性骨惡性腫瘤，主要發(fā)生在骨遠(yuǎn)端管狀骨和肱骨近端，具有惡性程度高、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移早的特點(diǎn)，也是其死亡的主要原因。手術(shù)治療和輔助化療是治療骨肉瘤的主要方法［19］。然而，目前的化療藥物如順鉑、5-氟尿嘧啶、阿霉素、甲氨蝶呤等有骨髓抑制、肝功能損傷、惡心嘔吐等許多副作用［20］。因此，尋找新的、治療效果好的、毒副作用低的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。

Figure 1.Effect of andrographolide（AG）on the proliferation of osteosarcoma 143B cells.A：the change of the total number of 143B cells after AG treatment was detected by crystal violet staining；B：the colony formation ability of 143B cells was detected by the colony formation assay（crystal violet staining）；C：the viability of 143B cells was detected by MTT assay；D：the expression of proliferation-related protein PCNA was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 AG對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞增殖能力的影響

穿心蓮內(nèi)酯是從穿心蓮植物中提取出來(lái)，具有多種藥理活性。據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，AG具有抗多種腫瘤的作用，而且效果顯著。AG可以通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制前列腺癌［14］、胃癌［16］和黑色素瘤細(xì)胞［21］增殖；還可抑制TLR4信號(hào)通路活性，誘導(dǎo)結(jié)腸癌［17］和前列腺癌［22］凋亡；AG可通過(guò)下調(diào)Bcl-2的蛋白水平，并激活caspase信號(hào)級(jí)聯(lián)從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞［16］凋亡；通過(guò)上調(diào)miR-218抑制口腔癌侵襲性，降低Bmi1的表達(dá)而抑制口腔癌的干性［15］。還可以與阿霉素連用而發(fā)揮抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用［23］。以上的研究結(jié)果充分說(shuō)明穿心蓮內(nèi)酯可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抑癌作用。但是，AG對(duì)人骨肉瘤的影響和作用及其潛在的機(jī)制仍然有待進(jìn)一步的探索。

Figure 2.Effect of andrographolide（AG）on the apoptosis of osteosarcoma 143B cells.A，B：Hoechst 33258 staining（×200）and flow cytometry were performed to detect the apoptosis of 143B cells；C：the protein levels of antiapoptotic protein Bcl-2，pro-apoptotic protein Bax，and apoptosis-related proteins caspase-3，cleaved caspase-3（c-caspase-3），PARP and cleaved PARP（c-PARP）were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 AG對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3.A：the wound-healing test was performed to measured the effect of andrographolide on the migration ability of osteosarcoma 143B cells（×100）；B：the effect of andrographolide on the invasive ability of osteosarcoma 143B cells was tested by transwell assay（crystal violet staining，×100）；C：the protein levels of migration and invasion related proteins vimentin，Snail and MMP-9 were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 AG對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 4.The effects of AG on the expression levels of Wnt/β-catenin pathway-related proteins（including β-Catenin and c-Myc）in the osteosarcoma 143B cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 AG對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞WNT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

本研究中，我們對(duì)AG作用于骨肉瘤143B細(xì)胞的抗腫瘤作用及其可能的機(jī)制進(jìn)行了探索。細(xì)胞增殖失控是腫瘤細(xì)胞的基本特征，腫瘤細(xì)胞通過(guò)解除正常的促生長(zhǎng)信號(hào)產(chǎn)生和釋放從而達(dá)到維持細(xì)胞增殖，抵抗凋亡的作用［24］。于是我們使用了結(jié)晶紫染色法、集落形成實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)以及Western blot實(shí)驗(yàn)去證實(shí)了AG能夠抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖，并且降低增殖相關(guān)蛋白PCNA的水平。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自殺或程序性細(xì)胞死亡，是通過(guò)激活進(jìn)化保守的細(xì)胞通路介導(dǎo)的。凋亡可以通過(guò)外部或內(nèi)部（線(xiàn)粒體）途徑發(fā)生。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）和促凋亡蛋白（Bid、Bax、Bad）。當(dāng)促凋亡蛋白在線(xiàn)粒體中被激活時(shí)，它與另一種促凋亡因子APAF1結(jié)合形成“凋亡體”復(fù)合物。然后凋亡體復(fù)合體激活一系列caspases，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞死亡。TNF受體超家族通過(guò)配體-受體相互作用發(fā)生，就會(huì)啟動(dòng)capspase-8的激活，進(jìn)而激活下游執(zhí)行靶蛋白，觸發(fā)外源性細(xì)胞凋亡［25］。細(xì)胞凋亡為有效的抗癌治療提供了一些線(xiàn)索，但是缺乏凋亡誘導(dǎo)和不適當(dāng)?shù)牡蛲隹刂七^(guò)程涉及腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展以及耐藥。Sukardiman等［26］發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的抗腫瘤作用。我們的研究結(jié)果表明，AG使143B細(xì)胞凋亡率增加，并且使抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，促進(jìn)caspase凋亡途徑中cleaved caspase-3的蛋白水平增多，而使caspase-3的蛋白水平下降。因而可以說(shuō)明AG可以促進(jìn)143B細(xì)胞的凋亡。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程，其主要特征是上皮細(xì)胞極性的喪失以及間質(zhì)細(xì)胞特征的發(fā)展，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力［27］。拉毛卓瑪?shù)龋?8］證實(shí)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化可以促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)以及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AG能夠顯著地抑制人骨肉瘤細(xì)胞143B細(xì)胞的遷移和侵襲，下調(diào)遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-9、vimentin和Snail的表達(dá)水平。以上結(jié)果顯示，AG可能是通過(guò)逆轉(zhuǎn)骨肉瘤143B細(xì)胞EMT進(jìn)程從而抑制其遷移和侵襲能力。

文獻(xiàn)報(bào)道Wnt信號(hào)通路的激活是骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素［29］。而Wnt信號(hào)通路中的c-Myc的表達(dá)降低與抗腫瘤相關(guān)，并且將會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［30］。本研究使用Western blot檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)AG可以明顯降低β-catenin蛋白的表達(dá)量，同時(shí)也使Wnt信號(hào)通路下游的靶蛋白c-Myc的表達(dá)量顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明AG可能通過(guò)抑制143B細(xì)胞中的Wnt信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗骨肉瘤的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了AG能抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖作用，并且促進(jìn)其凋亡，其潛在機(jī)制可能是抑制Wnt信號(hào)通路。這些結(jié)果證明，AG具有良好的抗癌作用，這可能為AG作為新的治療骨肉瘤候選藥物提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)我們將進(jìn)一步了解該藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)骨肉瘤的抑制作用。