曾凱輝，呂慧瑩，羅金泰，趙子良△

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，2廣州市越秀區(qū)光塔街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州510120）

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增長，且復(fù)發(fā)率高［1］，因此尋找一種能夠治療膀胱癌的藥物具有重要意義。普魯卡因（procaine，PCA）是一種局麻藥物，但在許多疾病的臨床治療中有廣泛的應(yīng)用，如呼吸科、婦產(chǎn)科、皮膚科和神經(jīng)科疾病以及惡性腫瘤等［2］。CXC趨化因子受體7（CXC chemokine receptor 7，CXCR7）是一種趨化因子受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，與膀胱癌的臨床分期和預(yù)后相關(guān)［3］，并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）是PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，調(diào)控其下游增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)信號(hào)，AKT磷酸化后才被激活［1-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，AKT信號(hào)通路可能是CXCR7發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路［6］，CXCR7能夠激活A(yù)KT信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡［7］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化后可調(diào)控下游靶基因，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［8-9］。本實(shí)驗(yàn)研究了PCA及CXCR7對膀胱癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲的影響，并分析了PCA和CXCR7之間的關(guān)系以及它們對AKT/STAT3信號(hào)通路的影響，為膀胱癌的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)并為藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料與試劑

人膀胱癌RT4細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；Taq DNA Polymerase和AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix購自南京諾唯贊生物公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PCA購自武漢鑫佳靈生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RT4細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

2.2 PCA處理膀胱癌細(xì)胞 取對數(shù)生長期的RT4細(xì)胞消化后接種于96孔板（每孔1×104個(gè)），DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，吸去原培養(yǎng)液，換成含不同濃度（0、0.25、1、4和16 mmol/L）PCA的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求收集細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 PCA實(shí)驗(yàn)分為PBS組和PCA組，以未經(jīng)PCA處理的RT4細(xì)胞作為PBS組，以4 mmol/L PCA處理的RT4細(xì)胞作為PCA組；CXCR7敲減實(shí)驗(yàn)分為siRNA陰性對照（siRNA negative control，si-Con）組和CXCR7siRNA（si-CXCR7）組，將si-Con和si-CXCR7分別轉(zhuǎn)染到RT4細(xì)胞中；CXCR7過表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為PBS組、PCA組、PCA+pcDNA組和PCA+pcDNA-CXCR7組，前2組與PCA實(shí)驗(yàn)中相同處理，后2組的處理為將pcDNA和pcDNA-CXCR7分別轉(zhuǎn)染至4 mmol/L PCA處理的RT4細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

2.4 RT-qPCR分析CXCR7的mRNA表達(dá)水平 按照TRIzol說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照AceQ qPCR SYBR?Green Master Mix說明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。循環(huán)條件為95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長5 min。目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。CXCR7的上游引物序列為5′-TGGGTGGTCAGTCTCGT-3′，下游引物序列為5′-CCGGCAGTAGGTCTACT-3′；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物序列為5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

2.5 CCK-8法測定RT4細(xì)胞活力的變化 分別取不同濃度PCA處理的對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，接種于96孔板（每孔5×103個(gè)）培養(yǎng)，分別于24、48和72 h培養(yǎng)時(shí)點(diǎn)，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。取si-Con組、si-CXCR7組、PCA+pcDNA組和PCA+pcDNA-CXCR7組的對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，接種于96孔板（每孔5×103個(gè)）培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀測定各孔波長450 nm處的吸光度（A），另設(shè)單孔只加培養(yǎng)基作為空白對照。細(xì)胞活力（%）=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對照組×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力收集各組穩(wěn)定表達(dá)的膀胱癌RT4細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，接種于Transwell小室上層（每孔3×103個(gè)細(xì)胞）。Transwell小室風(fēng)干后，加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)參考賀晶等［10］的方法，在Transwell小室上層加入50 μL 2.0 g/L基質(zhì)膠Matrigel，凝固后接種RT4細(xì)胞，之后操作同細(xì)胞遷移。

2.7 Western blot法檢測蛋白水平 收集穩(wěn)定表達(dá)的各組RT4細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。各組蛋白上樣量為60 μg，經(jīng)SDSPAGE分離后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入I抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入相對應(yīng)的II抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，然后在暗室中顯影，定影。用Tanon 600系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析，測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度的PCA對RT4細(xì)胞活力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度PCA處理后RT4細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.05），見圖1。這一結(jié)果表明，PCA可抑制RT4細(xì)胞的活力。

Figure 1.The viability of the RT4 cells treated with procaine at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 mmol/L group.圖1 不同濃度普魯卡因?qū)T4細(xì)胞活力的影響

2 PCA對RT4細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組遷移和侵襲的RT4細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖2。這表明PCA可抑制RT4細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

3 PCA對RT4細(xì)胞CXCR7表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組膀胱癌RT4細(xì)胞中CXCR7的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖3A。Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細(xì)胞中CXCR7蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖3B?？梢奝CA抑制膀胱癌RT4細(xì)胞CXCR7的表達(dá)。

4 敲減CXCR7表達(dá)對RT4細(xì)胞的活力、遷移和侵襲的影響

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組RT4細(xì)胞中CXCR7的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖4A；Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組RT4細(xì)胞中CXCR7蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖4B；CCK-8法檢測結(jié)果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組RT4細(xì)胞的活力顯著降低（P＜0.05），見圖4C；Transwell法檢測結(jié)果顯示，相較于si-Con組，si-CXCR7組遷移和侵襲的RT4細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖4D、E。這表明抑制CXCR7表達(dá)可抑制RT4細(xì)胞的活力、遷移和侵襲。

5 過表達(dá)CXCR7逆轉(zhuǎn)PCA對RT4細(xì)胞活力、遷移和侵襲的抑制作用

Figure 2.Procaine（PCA）inhibited the migration（A）and invasion（B）abilities of the RT4 cells.The migration and invasion of the RT4 cells were detected by Transwell assays（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBS group.圖2 普魯卡因抑制RT4細(xì)胞的遷移和侵襲

Figure 3.Procaine（PCA）inhibited CXCR7 expression in the RT4 cells.A：the mRNA expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by RT-qPCR；B：the protein expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBS group.圖3 普魯卡因抑制RT4細(xì)胞中CXCR7的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細(xì)胞中CXCR7的mRNA表達(dá)水平顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組RT4細(xì)胞中CXCR7的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5A。Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細(xì)胞中CXCR7的蛋白表達(dá)水平顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組RT4細(xì)胞中CXCR7的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖5B。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組RT4細(xì)胞的活力顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組RT4細(xì)胞的活力顯著升高（P＜0.05），見圖5C。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組遷移和侵襲的RT4細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組遷移和侵襲的RT4細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.05），見圖5D、E。上述結(jié)果表明，過表達(dá)CXCR7可逆轉(zhuǎn)PCA對RT4細(xì)胞活力、遷移和侵襲的抑制作用。

6 過表達(dá)CXCR7和PCA對RT4細(xì)胞AKT/STAT3信號(hào)通路的影響

Western blot的檢測結(jié)果顯示，相較于PBS組，PCA組p-AKT和p-STAT3的蛋白水平顯著降低；相較于PCA+pcDNA組，PCA+pcDNA-CXCR7組p-AKT和p-STAT3的蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；而AKT和STAT3蛋白水平在各組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。上述結(jié)果表明，PCA抑制RT4細(xì)胞中AKT和STAT3的磷酸化，而過表達(dá)CXCR7可逆轉(zhuǎn)PCA對AKT和STAT3磷酸化的抑制作用。

討 論

Figure 4.Knock-down of CXCR7 expression inhibited the viability，migration and invasion of the RT4 cells.A：the mRNA expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by RT-qPCR；B：the protein expression of CXCR7 in the RT4 cells was detected by Western blot；C：the viability of the RT4 cells was detected by CCK-8 assay；D，E：the migration and invasion abilities of the RT4 cells were detected by Transwell assays（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-Con group.圖4 敲減CXCR7的表達(dá)抑制RT4細(xì)胞的活力、遷移和侵襲

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，研究膀胱癌的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)可給臨床診斷、治療和預(yù)后預(yù)測提供理論依據(jù)［11］。PCA是一個(gè)有前景的抗腫瘤藥物，還可以拮抗化療相關(guān)的腎臟和肝臟毒性［12-13］。研究表明高溫聯(lián)合PCA可在體外凈化白血病骨髓［14］。研究發(fā)現(xiàn) PCA 對人鼻咽癌 CNE-2Z細(xì)胞［15］和HepG2細(xì)胞［16］具有抑制增殖的作用。CXCR7參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，張娜等［4］研究發(fā)現(xiàn)CXCR7通過抗凋亡因子survivin參與胃癌的生長，并可能參與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)CXCR7在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制CXCR7表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［17］，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中具有抗腫瘤功能［18］。抑制CXCR7表達(dá)，前列腺癌細(xì)胞增殖減少［19］，并可減少腎癌細(xì)胞的遷移及侵襲［20］。林靈［21］的研究發(fā)現(xiàn)靶向干擾CXCR7表達(dá)可通過抑制Akt的磷酸化、下調(diào)bcl-2表達(dá)、上調(diào)多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1］表達(dá)從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

AKT在細(xì)胞存活、代謝、遷移和侵襲等信號(hào)通路中起著重要的調(diào)控作用，其在多種腫瘤中異常活化［22-23］。AKT能磷酸化一系列蛋白成分，通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡［24］。理論上靶向AKT基因抑制AKT的活性能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，因此抑制AKT的激活對腫瘤治療有重要意義［25］。STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膀胱癌的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮重要作用，異常高表達(dá)的磷酸化STAT3可能通過增加血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤血管的生成，導(dǎo)致膀胱腫瘤惡性進(jìn)展，靶向阻斷STAT3信號(hào)通路為膀胱癌的治療提供新的思路［26］。黃陳等［27］研究發(fā)現(xiàn)阻斷STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。CXCL-8可通過ATK和STAT3信號(hào)通路提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬和增殖能力［28］。來偉等［29］研究發(fā)現(xiàn) PRL-3能通過白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）上調(diào)p-AKT和p-STAT3促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移。趙勇［30］研究發(fā)現(xiàn)Hes1可通過激活PI3K/AKT和JAK/STAT3信號(hào)通路，減輕缺氧后心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕心肌細(xì)胞缺血在灌注損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCA處理及敲減CXCR7的表達(dá)可使膀胱癌RT4細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力顯著降低，說明PCA和CXCR7可能影響膀胱癌的發(fā)展過程。在PCA處理后的RT4細(xì)胞中轉(zhuǎn)入CXCR7過表達(dá)表質(zhì)粒可逆轉(zhuǎn)PCA對膀胱癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲能力的抑制作用。PCA處理后RT4細(xì)胞的p-AKT和p-STAT3蛋白水平顯著降低；過表達(dá)CXCR7可致膀胱癌RT4細(xì)胞細(xì)胞的p-AKT和p-STAT3蛋白水平顯著升高，說明PCA可抑制膀胱癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲，而過表達(dá)CXCR7可逆轉(zhuǎn)PCA對膀胱癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲的抑制作用，其機(jī)制可能與AKT和STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的研究成果可為膀胱癌的預(yù)防和治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 6.The effects of CXCR7 over-expression and procaine（PCA）on the protein levels of AKT/STAT3 signaling pathway-related molecules in the RT4 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs PBS group；#P＜0.05 vs PCA+pcDNA group.圖6 過表達(dá)CXCR7和普魯卡因?qū)T4細(xì)胞AKT/STAT3信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平的影響