嚴大為 鄭賽晶

摘 ?要：為了解電子煙的基因毒性及其評價方法，按照受試對象分類進行了綜述。其中以細菌為受試對象的試驗方法有細菌回復突變試驗和DNA損傷分析等;以離體細胞為受試對象的試驗方法有微核試驗、DNA雙鏈斷裂試驗、RNA轉錄測序試驗、定向基因檢測分析和Bhas細胞轉化試驗等;以模式動物為受試對象的試驗方法有長期吸入毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗等;以人體為受試對象的主要是臨床試驗和流行病學調查研究等。由于受試對象和試驗方法的差異性，導致電子煙基因毒性結果的可信度和可比性較差，因此建議在評價電子煙基因毒性的過程中，應至少考慮細菌、離體細胞、模式動物和臨床試驗等4個層次的受試對象，通過回復突變試驗、微核試驗、長期吸入毒性試驗和臨床試驗等多種試驗方法獲得多個基因毒性的試驗終點，科學、客觀和全面地綜合評價電子煙的基因毒性。

關鍵詞：電子煙;體內試驗方法;體外試驗方法;基因毒性

The Overview of Evaluation Methodology on E-cigarette Genotoxicity

YAN Dawei， ZHENG Saijing*

（Research Department of Chemistry， Shanghai New Tobacco Product Research Institute， Shanghai 200082， China）

Abstract：In order to understand the genotoxicity of e-cigarettes and its evaluation methodology， a review was conducted according to the classification of study subjects. The test methods using bacteria as the study subjects include bacterial reversion mutation test and DNA damage analysis. Methods using isolated cells as study subjects include micronucleus test， DNA double-strand breaking test， RNA transcriptional sequencing test， targeted gene detection and analysis， and Bhas cell transformation test. Long-term inhalation toxicity test and reproductive development toxicity test were used in the model animals. The human body as the study subject are mainly clinical trials and epidemiological investigations. Due to the differences of study subjects and test methods， the credibility and comparability of e-cigarettes genotoxicity results is poor. Therefore， it is recommended that in the process of ?e-cigarettes genotoxicity evaluation ， at least bacteria， isolated cell， animal models and clinical trials should be considered. Multiple genetic toxicity test endpoints can be obtained through a variety of test methods， such as reverse-mutation test， micronucleus test， long-term inhalation toxicity test， and clinical trial， which help to make a scientific， objective and comprehensive evaluation of ?e-cigarettes genotoxicity .

Keywords： E-cigarette; in vivo methodology; in vitro methodology; genotoxicity

基因毒性是指外源性因素能直接或間接損傷細胞DNA，產生致突變和致癌作用的程度。一般外源性因素，如某些化學物質等可在染色體水平、分子水平和堿基水平上造成基因損傷，從而引起致癌、致畸和致突變等毒性作用[1]。與此同時，隨著近年來電子煙的快速流行和傳播，其對人體健康的影響引起了公共衛(wèi)生組織和其他相關方的密切關注[2]。大部分研究表明電子煙的基因毒性較小，遠低于傳統(tǒng)卷煙[3-6];但也有一些研究表明電子煙對基因表達的影響遠大于傳統(tǒng)卷煙[7]。社會各界對于電子煙基因毒性的研究日益關注，但是采用的評價方法多參考醫(yī)藥或化學物質基因毒性的評價，沒有統(tǒng)一的受試對象、暴露方法和試驗終點指標等規(guī)范。因此本文對已發(fā)表的相關電子煙基因毒性的研究方法進行了綜述，并通過分析認為電子煙的基因毒性評價應至少考慮細菌、離體細胞、模式動物和臨床試驗等4個層次的受試對象，通過回復突變試驗、微核試驗、長期吸入毒性試驗和臨床試驗等多種試驗方法獲得多個基因毒性試驗終點，科學、客觀和全面地評價電子煙的基因毒性。

1 ?以細菌為受試對象

細菌回復突變試驗作為致突變物的早期篩選和研究手段，主要利用營養(yǎng)缺陷型菌株，在選擇培養(yǎng)基上經外源性物質處理后，觀察菌株的回復突變的情況，用來判斷外源性物質的致突變能力，是科研機構和政府公認的測定新化學物質和新藥潛在致突變的檢測方法[8]。對于電子煙基因毒性的評價，可以通過將電子煙氣溶膠整體看作外源性物質，通過細菌回復突變試驗檢測堿基水平上的基因毒性作用[9]。

THORNE等[6]使用吸煙機采用加拿大深度抽吸的方法產生電子煙氣溶膠，采取氣-瓊脂界面暴露染毒的方法，研究了電子煙氣溶膠和參比卷煙（3R4F）氣溶膠對TA98和TA100菌株致突變的影響，試驗結果表明在暴露濃度為1 L/min電子煙氣溶膠3 h后，兩種菌株均未發(fā)生突變現(xiàn)象，而同等條件下暴露相同濃度的參比卷煙氣溶膠3 h后的菌株發(fā)生突變現(xiàn)象。雖然該研究僅采用兩個菌株進行研究，且電子煙樣品種類較少，但是也從某種程度上說明電子煙在致基因突變方面，可以通過此類方法進行評價。同時他們還研究了極端試驗條件下的未稀釋電子煙氣溶膠的致突變性，研究結果表明在長達112.5 min的未稀釋電子煙氣溶膠暴露后，5種菌株均未發(fā)現(xiàn)致突變現(xiàn)象，該結果進一步說明電子煙氣溶膠致細菌回復突變能力較弱和該檢測方法的適用性[10]。

MANOJ等[11]通過細菌回復突變試驗，對電子煙和卷煙氣溶膠進行體外遺傳毒性的比較研究發(fā)現(xiàn)，電子煙氣溶膠捕集提取物的生物毒性比卷煙氣溶膠提取物低6000倍。同時試驗結果還顯示電子煙氣溶膠捕集提取物和電子煙煙液本身不存在可檢測的生物毒性差異。但BHARADWAJ等[12]利用重組大腸桿菌研究了電子煙煙液和電子煙氣溶膠毒性作用時發(fā)現(xiàn)，在暴露480 min的1∶4的稀釋電子煙氣溶膠后，大腸桿菌出現(xiàn)DNA損傷、離子穩(wěn)態(tài)、氧化應激和膜損傷等非致死影響。

由此可見，電子煙對細菌的基因毒性，與試驗方法中的菌株種類、試驗對象形態(tài)和暴露時間有一定的關系，因此在進行評價時，應選取公認的標準菌株TA98、TA100等，結合消費者的實際消費情況，采取氣-瓊脂界面暴露染毒的方法，選擇符合實際的暴露時間，觀察菌株的基因毒性情況，并在此基礎上對電子煙的基因毒性進行初步評價。

2 ?以細胞為受試對象

非臨床安全評價中采取離體細胞進行體外試驗研究廣泛應用于單一化學物質和復雜混合物的毒理學評價，常見的有染色體畸變試驗和微核試驗，均是檢測外源性物質基因毒性的試驗方法。此類試驗方法在電子煙氣溶膠總粒相物的基因毒性評價方面也有著成功的應用[13]。

2.1 ?哺乳動物細胞

微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內成為微核。通過檢測哺乳動物細胞分裂期間細胞質中微核情況的體外微核試驗，可以檢測電子煙對染色體的損傷情況。有研究表明參比卷煙3R4F氣溶膠中的總粒相物可導致DNA損傷，進而導致染色體斷裂形成微核，其微核形成率最大的劑量為0.12 mg/mL，高于此劑量則會引起細胞的大量死亡。而電子煙氣溶膠總粒相物濃度高達20 mg/mL時，仍未觀察到有微核的形成。認為電子氣溶膠總粒相物對細胞遺傳物質DNA的損傷顯著低于參比卷煙[11，14]。

2.2 ?人源支氣管上皮細胞

DNA的損傷有很多不同形式，如堿基修飾、DNA單鏈斷裂、DNA鏈內和鏈間交聯(lián)以及DNA雙鏈斷裂等，其中DNA雙鏈斷裂被認為DNA最嚴重的損傷。細胞在DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，產生一系列的應激反應，其中一個主要的反應就是毛細血管共濟失調突變基因（Ataxia Telangiectasia Mutated，ATM）起始的信號級聯(lián)反應，它可以使細胞周期停頓直到損傷修復。而H2AX是這一信號級聯(lián)反應中的一個主要成員，它能被ATM磷酸化（稱為γH2AX或gammaH2AX），并在隨后的損傷修復過程中發(fā)揮著重要的作用[15]，因此可以通過檢測γH2AX的含量對DNA的損傷情況進行評價[16]。研究人員發(fā)現(xiàn)，參比卷煙在細胞暴露界面沉積量0～26.9 ?g/m2的范圍內均出現(xiàn)γH2AX的陽性反應，而電子煙氣溶膠暴露達到85.7 ?g/m2的情況下，并未發(fā)現(xiàn)γH2AX的陽性反應結果[17]。因此通過檢測γH2AX的方法判斷電子煙氣溶膠對細胞的DNA損傷情況具有一定的可行性。

對離體細胞中RNA轉錄組進行測序，以判斷基因表達量的變化，最近也應用于電子煙氣溶膠的基因毒性研究[18]。通過RNA轉錄組進行測序發(fā)現(xiàn)，與空氣對照組相比，參比卷煙組有873個RNA基因表達出現(xiàn)極顯著性差異（p<0.01且差異倍數(shù)>2），經過48 h的恢復期后，仍有205個RNA基因表達出現(xiàn)極顯著性差異。而在同等尼古丁濃度的電子煙氣溶膠暴露后，未發(fā)現(xiàn)有RNA基因表達出現(xiàn)極顯著性差異（p<0.01且差異倍數(shù)>2），進一步研究發(fā)現(xiàn)，參比卷煙氣溶膠對肺癌、炎癥和纖維化相關的基因有明顯的影響，而電子煙氣溶膠則對生物代謝合成過程、細胞外膜、細胞凋亡、細胞缺氧、氧化應激、生長因子受體基因和三酰甘油脂肪酸代謝路徑的相關基因等有一定的影響[18-24]。

2.3 ?其他人源細胞

電子煙的基因毒性研究除選取常用的呼吸系統(tǒng)組織上皮細胞作為受試對象外，也可選取其他細胞系作為受試對象。如研究發(fā)現(xiàn)牙齦上皮細胞在暴露電子煙氣溶膠3 d后，其形態(tài)和乳酸脫氫酶的活性發(fā)生變化，基因caspase-3的表達顯著性增加，并與牙齦上皮細胞凋亡存在一定的關聯(lián)[25]。

在低濃度（25 μmol/L）情況下，卷煙氣溶膠提取物會造成血管內皮細胞DNA損傷，電子煙氣溶膠提取物未發(fā)現(xiàn)相關毒性。該損傷一般由自由基的產生所引起，最終會影響內皮細胞的活性[26]。但JACK等[27]研究發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈內皮細胞暴露電子煙后，并未引起細胞應激反應，相關應激基因NFR2的表達也未出現(xiàn)差異。

對人肺成纖維細胞（HFL-1）的研究發(fā)現(xiàn)，與空氣對照組相比，在電子煙氣溶膠暴露10～20 min后，會導致細胞線粒體內的活性氧（ROS）增加，降低細胞核DNA片段的穩(wěn)定性，同時細胞炎癥因子IL-8和IL-6的水平上升，這可能引起一系列的炎癥產生[28-30]。

關于非遺傳致癌毒性，Bhas細胞轉化試驗是一種非常有效的檢測方法。Bhas42細胞是將v-Ha-ras基因導入Balb/c3T3細胞中而建成的細胞系，已處于啟動狀態(tài)，在非遺傳毒性致癌物暴露影響下不經過啟動劑的預處理便可引起細胞惡性轉化。H2O2可以殺死未發(fā)生轉化的正常細胞，而對轉化細胞不產生影響。供試品處理后的細胞經CCK-8染色后，根據(jù)其存活率確定細胞轉化程度，從而判定供試品的非遺傳毒性[31]。研究表明參比卷煙煙氣的總顆粒物具有可以引起B(yǎng)has細胞轉化的能力，最低濃度達到6 ?g/mL，相反電子煙氣溶膠總顆粒物則未引起B(yǎng)has細胞轉化，試驗濃度高達120 ?g/mL[32]。

從上述研究來看，通過對微核試驗、RNA轉錄組測序和特定基因的檢測等試驗方法，可以檢測電子煙的相關基因毒性[33]。同時離體細胞成本低廉，操作相對簡單，試驗周期較短，是進行電子煙基因毒性評價的理想受試對象。

3 ?以模式動物為研究對象

由于離體細胞或組織不能模擬人體內部各個系統(tǒng)相互作用的復雜過程，更無法預測電子煙氣溶膠對人體內部的各個器官產生的基因毒性作用，因此一般將體內毒性試驗作為電子煙基因毒性研究的標準方法[34]。

在呼吸系統(tǒng)方面，有研究表明長期暴露電子煙氣溶膠后，發(fā)現(xiàn)肺部致癌相關的P450代謝酶系CYP1A1/2、CYP2B1/2、2C11和CYP3A等代謝酶的數(shù)量顯著增加，活性氧（ROS）水平也顯著增加。同時還發(fā)現(xiàn)血液樣品中存在較高的微核率，尿液中的DNA出現(xiàn)點突變等遺傳毒性[35]。同時DNA甲基化受到影響，進一步影響小鼠的肺部功能，造成IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的大量增加[36]。支氣管功能也受到干擾，可導致產生系統(tǒng)性炎癥和器官纖維化等情況[37]。

在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育毒性方面，發(fā)現(xiàn)仔鼠腦部前額組織有109個基因表達存在顯著性差異（p<0.01），這些基因表達的差異與后續(xù)神經系統(tǒng)發(fā)育毒性具有一定的相關性[38]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，母鼠暴露電子煙氣溶膠后可以導致仔鼠的認知能力退化，這可能是由于與調節(jié)神經活動相關的基因Aurka、Aurkb、Aurkc、Kdm5c、Kdm6b、Dnmt3a、Dnmt3b和Atf2表達發(fā)生了顯著變化所引起[39]。取小鼠大腦中海馬組織后發(fā)現(xiàn)，Ngfr和Bdnf基因表達也受到影響，這對中樞神經系統(tǒng)正常發(fā)育存在潛在威脅[40]。在子代的胚胎發(fā)育過程中暴露電子煙氣溶膠，可引起一定的出生缺陷[41]。除了在生殖發(fā)育方面的基因毒性影響，電子煙氣溶膠還可引起肝功能異常。研究發(fā)現(xiàn)肝臟功能的生物標志物GSK3在暴露電子煙氣溶膠后，該基因的表達顯著上升[42]。

綜上所述，通過模式動物整體暴露試驗，可以評價電子煙氣溶膠對動物體內不同系統(tǒng)的基因毒性大小，但由于模式動物和人類存在暴露方式差異，應考慮與人類吸食電子煙類似的方式進行暴露，選取可靠公認的基因毒性指標，觀察模式動物的時效和量效效應，以獲得準確可比的電子煙基因毒性試驗數(shù)據(jù)。

4 ?以人體為受試對象

2011—2014年間，美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)起了一項煙草與公眾健康評估研究（PATH， Population Assessment of Tobacco and Health）。通過對32 320名國民調查研究發(fā)現(xiàn)，當前使用電子煙的主要原因是消費者認為電子煙比傳統(tǒng)卷煙對身體健康的危害小，如由于基因毒性引起的致癌等疾病可能性較低[43]。但一些媒體、政府和醫(yī)療網(wǎng)站卻報道使用電子煙后呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等會產生基因毒性影響[44]。為了解電子煙的真實基因毒性情況，尤其是對免疫系統(tǒng)基因表達的影響，MELANIE等[45]進行了一項臨床試驗研究。他們收集了非吸煙者（13人）、傳統(tǒng)卷煙消費者（14人）和電子煙消費者（12人）的鼻腔表面刮擦組織、鼻灌洗液、尿液和血清等樣本，對樣本中免疫基因表達譜的變化進行分析，并比較電子煙和傳統(tǒng)卷煙對呼吸系統(tǒng)的生物效應。通過對597個免疫相關基因檢測研究發(fā)現(xiàn)，與非吸煙者相比，電子煙消費者有358個與免疫相關的基因發(fā)生表達量下調，而傳統(tǒng)卷煙消費者僅有53個基因發(fā)生表達差異，并且全部包含于電子煙消費者表達差異的基因之中，這說明從傳統(tǒng)卷煙轉吸電子煙時，未能改變免疫系統(tǒng)的基因表達量減少的情況，還可能對消費者免疫功能調節(jié)產生更多的不利影響。此類臨床試驗結果可直觀反映電子煙的基因毒性，但往往臨床樣本相對較少，且樣本個體差異性較大，代表性較差，試驗數(shù)據(jù)的充分性和可靠性需要進一步擴大臨床試驗進行驗證。

5 ?小結與展望

一般而言，電子煙基因毒性的研究層次包括體外試驗、體內試驗、人體試驗和流行病學研究，研究結果的權重由小到大，且各有優(yōu)缺點（表1）。常見試驗方法有AMES試驗、哺乳動物細胞基因突變試驗（TK試驗）、染色體畸變試驗、微核試驗、顯性致死試驗、程序外DNA合成試驗、姐妹染色單體交換試驗、單細胞凝膠電泳試驗和轉基因動物致突變試驗等。電子煙的基因毒性產生的原因較多，除電子煙中尼古丁本身對神經系統(tǒng)基因有一定的影響之外[46]，電子煙煙液中的溶劑和添加劑也是影響因素，如電子煙氣溶膠中的肉桂醛具有一定基因毒性，可損傷呼吸系統(tǒng)中免疫細胞的正常功能[47-49]。一些香精香料添加劑還可引起口腔上皮細胞和牙周纖維細胞的炎癥反應以及DNA損傷等癥狀[50-51]，因此電子煙的基因毒性難以通過單一的毒性機制進行闡述，是多種化學物質共同作用的結果。但也有研究表明添加劑對線蟲的基因毒性效應影響不大，這可能與添加劑的種類和添加量有關[52]。因此，對于電子煙氣溶膠整體的基因毒性評價較為困難。同時電子煙氣溶膠的基因毒性還可能與電子煙的使用頻率、使用時煙具工作條件以及氣溶膠產生過程等多種因素相關，因此需要對電子煙基因毒性的評價方法進行規(guī)范和總結，如確定電子煙器具的工作模式和抽吸模式，電子煙氣溶膠的暴露方式和暴露時間，以及受試對象的種類。雖然文獻中通過一些特定方式，發(fā)現(xiàn)相關電子煙氣溶膠的基因毒性，但是這些毒性評價是否對電子煙整體的基因毒性具有代表性和權威性，仍然值得商榷。

總之，目前關于電子煙的基因毒性，雖然在不同研究水平上均有一些研究方法和成果，但是可利用文獻和數(shù)據(jù)數(shù)量較少，大量文獻研究還是體外基因毒性研究方法，臨床基因毒性研究和流行病學調查研究相對較少，并且每個研究層次水平上研究方法還未形成共識[53-57]。從研究結果的代表性、科學性、真實性和規(guī)范性等方面來說，目前的科研結果還難以對電子煙基因毒性做出客觀評價。應在電子煙基因毒性的受試對象、暴露方式、暴露劑量、試驗指標和結果評價等方面形成一致的標準方法，至少考慮細菌、離體細胞、模式動物和臨床試驗等4個層次的受試對象，通過回復突變試驗、微核試驗、長期吸入毒性試驗和臨床試驗等多種試驗方法獲得多個基因毒性試驗終點，科學、客觀和全面地評價電子煙的基因毒性，構建電子煙基因毒性評價的科學體系，才是客觀評價電子煙基因安全性的當務之急。

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作者簡介：嚴大為（1985-），男，工程師，碩士，主要從事新型煙草制品風險評價研究。E-mail：yandw@sh.tobacco.com.cn

*通信作者，E-mail：zhengsj@sh.tobacco.com.cn

收稿日期：2019-09-26 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-02-11