謝廣妹，楊杰，許思娟，安錦霞，倪亞莉

(甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730050)

近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、競爭壓力的增加以及生育年齡的推遲，不孕癥發(fā)病率在逐年上升，我國女性不孕癥發(fā)病率約為15%[1-2]。以體外受精-胚胎移植(IVF-ET)為主要代表的輔助生殖技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展造福了數(shù)千萬不孕癥家庭[2]。正常情況下，機(jī)體的氧化和抗氧化狀態(tài)保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)活性氧(ROS)產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，最終造成細(xì)胞功能的異常[3-4]。輔助生殖技術(shù)過程中的諸多因素都可以導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的產(chǎn)生及ROS的增加，進(jìn)而影響輔助生殖治療結(jié)局，因此，氧化應(yīng)激對(duì)輔助生殖技術(shù)和人類生育潛能的影響在近年來也越來越受到關(guān)注[5]。目前，關(guān)于高齡女性患者中IVF助孕時(shí)卵泡液中氧化應(yīng)激狀況及其對(duì)IVF結(jié)局影響的研究不多，且存在一定爭議，與卵巢刺激方案的不同也存在一定的關(guān)系。因此，本研究旨在關(guān)注高齡女性患者不同卵巢刺激方案的卵泡液中ROS和TAC表達(dá)水平及其與輔助生殖治療結(jié)局間的相關(guān)性。

材料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年1～12月在甘肅省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行輔助生殖治療的高齡女性患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性年齡≥35歲；(2)不孕為單純輸卵管因素；(3)男方性激素檢測正常、精液正常；(4)所有患者在3個(gè)月之內(nèi)未進(jìn)行任何藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮畸形及宮腔黏連患者；(2)患者夫婦患有其他內(nèi)分泌疾病。

共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者194例，按照促排卵(COH)方案不同分為短效長方案組(n=52)、拮抗劑組(n=47)、超長方案組(n=45)和高孕酮狀態(tài)下促排卵(PPOS)組(n=50)。

二、研究方法

1.促排卵方案：(1)短效長方案：于前一周黃體酮中期開始肌肉注射短效GnRH-a(達(dá)必佳，輝凌，德國)0.05～0.1 mg/d進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)至HCG注射日，降調(diào)節(jié)14～16 d達(dá)到啟動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)后開始促排卵。(2)拮抗劑方案：于月經(jīng)第1～3天開始啟動(dòng)促排卵，結(jié)合陰道B超監(jiān)測卵泡生長情況和血清激素水平，當(dāng)卵泡≥14 mm時(shí)開始肌肉注射拮抗劑思則凱(Baxter，德國)0.25 mg/d至HCG注射日。(3)超長方案：于月經(jīng)第1～3天肌肉 注射GnRH-a 3.75 mg×2～3支，最后一支注射30 d后行B超和血清激素檢測，垂體達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后開始給予外源Gn(醋酸亮丙瑞林，北京博恩特)促排卵，根據(jù)B超檢測卵泡情況以及血清激素水平調(diào)整Gn劑量。(4)PPOS方案：于月經(jīng)第1～3天開始使用安宮黃體酮片(浙江仙琚制藥)10 mg/d和注射用尿促性素(寧波人健藥業(yè))225 U/d 至HCG扳機(jī)日。2種藥物劑量在促排卵過程中保持恒量。根據(jù)卵泡直徑、血清激素水平確定扳機(jī)時(shí)間。

2.資料采集及卵泡液收集：采集所有患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌等資料。取卵日早晨空腹收集卵泡液，超聲引導(dǎo)下首先穿刺位置最低的1枚大卵泡(直徑在20 mm左右)，穿刺時(shí)穿刺針盡量避開血管，適當(dāng)壓力抽吸，抽吸干凈后，將無血液污染的卵泡液送入胚胎實(shí)驗(yàn)室單獨(dú)放置，并標(biāo)注姓名，日期等相關(guān)信息。解剖鏡下卵母細(xì)胞尋找完成后，立即將卵泡液于300g離心20 min，隨后取上清液分裝至無菌Eppendoff 管中，置于-80℃冷凍保存。批量檢測，避免反復(fù)凍融，以保證測定的可靠性和穩(wěn)定性。

3.主要評(píng)價(jià)指標(biāo)：記錄患者行促排卵時(shí)的Gn時(shí)間、Gn總量、AMH、竇卵泡數(shù)(AFC)、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)及臨床妊娠率等。

4.氧化應(yīng)激檢測：提取中心保存的194例患者血清樣本，送至甘肅省婦幼保健院臨床檢驗(yàn)中心。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組卵泡液中活性氧ROS、超氧化物歧化酶SOD、總抗氧化能力TAC、谷胱甘肽GSH以及丙二醛MDA含量。ELISA試劑盒均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，具體步驟按試劑盒說明書操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組患者的基本臨床資料

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組患者的年齡、不孕年限、LH和PRL水平均無顯著性差異(P>0.05)；超長方案組FSH水平顯著高于其余3組(P<0.05)，但其余3組間的FSH水平無顯著差異(P>0.05)；短效長方案組和PPOS組E2水平顯著高于拮抗劑組和超長方案組(P<0.05)，但短效長方案組和PPOS組、拮抗劑組和超長方案組間E2水平均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組患者一般情況(-±s)

注：與超長方案組比較，*P<0.05；與短效長方案組和PPOS組比較，#P<0.05

二、各組促排卵情況

組間分析結(jié)果顯示：與短效長方案組相比，拮抗劑方案組、超長方案組和PPOS方案組的Gn時(shí)間顯著升高(P<0.05)，AFC顯著降低(P<0.05)；與拮抗劑方案相比，超長方案組的AFC顯著升高(P<0.05)，而PPOS方案組的Gn時(shí)間和AFC均無顯著性差異(P>0.05)；與超長方案組相比，PPOS方案組的Gn時(shí)間無顯著性差異(P>0.05)，AFC顯著降低(P<0.05)；各組間的Gn總量和AMH水平均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者促排卵情況比較(-±s)

注：與短效長方案組比較，*P<0.05；與拮抗劑組比較，#P<0.05；與超長方案組比較，△P<0.05

三、不同促排卵方案對(duì)卵泡液氧化應(yīng)激水平的影響

氧化應(yīng)激指標(biāo)分析結(jié)果表明：與短效長方案組相比，拮抗劑方案組ROS、MDA含量顯著升高(P<0.05)，超長方案組SOD含量顯著升高(P<0.05)；與拮抗劑方案組相比，超長方案組ROS和MDA含量均顯著降低，而GSH、SOD和TAC含量均顯著升高(P<0.05)，PPOS方案組中僅MDA濃度顯著降低(P<0.05)；與超長方案組相比，PPOS方案組僅SOD含量顯著降低(P<0.05)，其余指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。

四、不同超促排卵方案ART結(jié)局比較

不同超促排卵方案ART各指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：與短效長方案相比，拮抗劑方案獲卵數(shù)、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)，超長方案組除卵裂率外其余指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)，PPOS組獲卵數(shù)顯著升高，而受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)；與拮抗劑方案相比，超長方案組除卵裂率外其余指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)，PPOS組僅獲卵數(shù)顯著升高(P<0.05)而其余指標(biāo)無顯著性差異；與超長方案相比，PPOS方案獲卵數(shù)、卵成熟率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率均顯著降低(P<0.05)；卵裂率在各組之間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表3 不同促排卵方案之間卵泡液氧化應(yīng)激水平的比較(-±s)

注：與短效長方案組比較，*P<0.05；與拮抗劑相比，#P<0.05；與超長方案組比較，△P<0.05

表4 不同促排方案之間ART結(jié)局的比較[(-±s)，%]

注：與短效長方案組比較，*P<0.05；與拮抗劑相比，#P<0.05；與超長方案組比較，△P<0.05

討 論

隨著時(shí)代的發(fā)展，女性社會(huì)角色的轉(zhuǎn)換，越來越多的婦女推遲生育年齡，加上二胎政策的放開，使得就診不孕人群日漸增多[6]。女性生育能力隨著年齡的增長而下降，在輔助生殖項(xiàng)目中，高齡婦女妊娠率和植入率都要比年輕患者低得多[7]。目前，雖然對(duì)于女性高齡生育年齡沒有確切的定義，但諸多經(jīng)典的大樣本流行病調(diào)查認(rèn)為，35歲以上婦女卵巢的儲(chǔ)備卵泡數(shù)目和卵母細(xì)胞質(zhì)量明顯下降，成為影響其妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素。隨著年齡的增加，女性不孕癥發(fā)生率明顯增高，有文獻(xiàn)報(bào)道，35～39歲女性不孕癥發(fā)生率約為30%，40～44歲女性的不孕率高達(dá)64%[8]。因此，選擇輔助生殖技術(shù)助孕的高齡不孕患者也隨之增多。

促排卵的目的是應(yīng)用促排卵藥物使多個(gè)卵泡同步發(fā)育成熟，獲得多個(gè)卵細(xì)胞，從而獲得更多可供移植的胚胎，提高臨床妊娠率[9]。選擇個(gè)體化的刺激方案是輔助生殖技術(shù)中的重點(diǎn)。GnRH-a長方案、GnRH-a短方案以及拮抗劑方案是目前臨床上常用的方案。陳軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢竇卵泡數(shù)不同患者行上述3種超促排卵方案時(shí)獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率均無顯著性差異；拮抗劑方案臨床妊娠率高于GnRH-a長方案和GnRH-a短方案，但無顯著差異。孫艷蘭等[10]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者行不同超促排卵后，短方案組FSH水平、LH值顯著高于超長方案，而竇卵泡數(shù)、Gn天數(shù)、Gn用量及獲卵數(shù)均顯著低于超長方案。本研究發(fā)現(xiàn)，短效長方案組和超長方案組的成熟卵率、受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于拮抗劑方案組；短效長方案組Gn時(shí)間顯著高于其他3組，竇卵泡數(shù)均顯著低于后者；短效長方案組和超長方案組的臨床妊娠率顯著高于拮抗劑方案和PPOS方案；各組AMH、Gn總量及卵裂率均無顯著性差異。我們的研究結(jié)果和以往研究基本一致[11-12]。

氧化應(yīng)激是活性氧產(chǎn)生過多或抗氧化能力受損而引起的一種氧化/抗氧化失衡狀態(tài)[13-14]。近年來，在腹膜液、卵泡液和輸卵管積水等重要的生殖微環(huán)境內(nèi)都檢測到ROS的存在[15-17]。氧化應(yīng)激可以引起一系列女性生殖相關(guān)疾病，如子宮內(nèi)膜異位癥、不明原因性不孕等[18]。卵泡液內(nèi)氧自由基和清除劑含量可直接影響卵母細(xì)胞的生長和發(fā)育潛力[19]。有研究表明，氧化應(yīng)激可能通過誘導(dǎo)染色體和線粒體DNA的損傷而直接降低PCOS患者的生育能力[4]。已有研究證實(shí)，卵泡微環(huán)境中氧化和抗氧化平衡狀態(tài)和卵子成熟度相關(guān)，同時(shí)，受精率和妊娠率也隨著抗氧化水平的升高而增加[20-21]。此外，還有研究表明，顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激能夠?qū)е翫NA氧化產(chǎn)物含量的增加，最終導(dǎo)致受精率和細(xì)胞質(zhì)量的降低[22]。ROS的增加和抗氧化能力的減弱可引起高齡女性卵母細(xì)胞質(zhì)量的降低[3]。Lai等[17]的研究也發(fā)現(xiàn)PCOS患者顆粒細(xì)胞中ROS水平的升高，極大地誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，降低了PCOS女性IVF-ET妊娠結(jié)局。本研究發(fā)現(xiàn)，拮抗劑方案組的ROS含量明顯高于短效長方案組、超長方案組以及PPOS方案組，臨床妊娠率顯著低于短效長方案組和超長方案組，和PPOS方案組雖無顯著性差異，但仍相對(duì)較低。這表明，高齡女性采用拮抗劑方案時(shí)，相比其他各方案，卵泡液氧化應(yīng)激水平越高，ART結(jié)局較差。

研究表明，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎細(xì)胞內(nèi)部存在非酶性抗氧化物(維生素、半胱氨酸等)和酶性抗氧化物(SOD、GSH等)可以拮抗ROS的產(chǎn)生[23]。SOD能夠反映機(jī)體抗氧化和氧化水平、清除體內(nèi)自由基，進(jìn)而避免卵細(xì)胞遭遇氧化應(yīng)激的傷害[16]。Matos等[24]研究發(fā)現(xiàn)，高齡女性顆粒細(xì)胞中SOD水平低于正常值。我們的研究發(fā)現(xiàn)，高齡女性患者行不同促排卵方案時(shí)，超長方案組的抗氧化水平(SOD、TAC、GSH)顯著高于拮抗劑組、短效長方案組和PPOS方案組，而且該方案下的成熟卵率、受精率，優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率也均高于拮抗劑組和PPOS方案組，表明高齡患者體內(nèi)的抗氧化水平和ART結(jié)局具有一定的關(guān)聯(lián)性。

總之，行不同超促排卵方案的高齡女性患者間氧化應(yīng)激水平和ART結(jié)局存在差異，其中超長方案組的FSH水平、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率均高于短效長方案組、拮抗劑組和PPOS組，前者的抗氧化水平同樣高于后者。因此，我們推測，超長方案更適用于高齡女性不孕患者，可以獲得較好的妊娠結(jié)局，而且妊娠結(jié)局和氧化應(yīng)激水平具有一定的相關(guān)性。