郭 笳 謝慧盈 張 振 胡利莎 劉玉盟 馬培振 王海艷 李 翠

中國常見貽貝基于28S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析*

郭 笳1,3謝慧盈3張 振1, 4胡利莎1, 2, 4劉玉盟1, 2, 4馬培振1, 4王海艷1, 4①李 翠1, 4①

(1．中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2．中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 3. 中國海洋大學(xué) 青島 266100; 4.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 青島 266071)

貽貝隸屬于軟體動物門 (Mollusca)、雙殼綱 (Bivalvia)、翼形亞綱 (Pteriomorphia)、貽貝目 (Mytilida)、貽貝超科 (Mytiloidea), 大約有400種貽貝分布在世界各地, 可適應(yīng)淡水、潮間帶至深海多種生境。本實(shí)驗(yàn)以貽貝科6亞科12屬28種中國沿海常見貽貝的28S rDNA為目的片段, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹, 運(yùn)用最大似然法和貝葉斯推演法分析了貽貝科的系統(tǒng)發(fā)生, 并追蹤貽貝科物種系統(tǒng)演化歷史。結(jié)果顯示: 貽貝亞科Mytilinae偏頂蛤亞科Modiolinae、石蟶亞科Lithophagina均非單系群。在屬階元, 深海偏頂蛤?qū)?、貽貝屬和股貽貝屬為單系群。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)接受將原隔貽貝屬分為屬和屬的分類提議; 應(yīng)接受將原石蟶屬中的膜石蟶亞屬提升至屬的地位的分類提議。此外, 短齒蛤?qū)俚膯蜗敌圆槐恢С? 刻緣短齒蛤并未與短齒蛤?qū)倨渌锓N在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚攏, 親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 為不同屬物種, 建議恢復(fù)刻緣短齒蛤原屬名(Dunker, 1857)。

貽貝; 28S rRNA; 系統(tǒng)發(fā)育

貽貝科在分類單元上屬于軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、翼形亞綱(Pteriomorphia)、貽貝目(Mytilida), 中國記載在冊的種有70余種(王禎瑞, 1997), 是我國重要的海洋經(jīng)濟(jì)作物。對貽貝科較為系統(tǒng)的分類始于Newell (1969), 他結(jié)合現(xiàn)生和化石雙殼類特征, 將貽貝科Mytilidae并分為4個亞科, 分別為: 貽貝亞科Mytilinae; 細(xì)齒蛤亞科Crenellinae; 偏頂蛤亞科Modiolinae; 石蟶亞科Lithophaginae。后來的分類學(xué)者在此基礎(chǔ)上不斷增加新的亞科, Bieler等(2010)在前人基礎(chǔ)上將貽貝科分為8個亞科, 包括貽貝亞科Mytilinae、細(xì)齒蛤亞科Crenellinae、石蟶亞科Lithophaginae、偏頂蛤亞科Modiolinae、深海貽貝亞科Bathymodiolinae、亞科Septiferinae、亞科Dacrydiinae、亞科Limnoperninae; Morton (2015)將貽貝科提升到超科水平并重新劃分為4個科13個亞科。目前, 國內(nèi)外分類學(xué)者依據(jù)形態(tài)對貽貝科內(nèi)各階元的劃分尚未達(dá)成一致結(jié)論。我國分類學(xué)者王禎瑞 (1997)主要依據(jù)Newell (1969)的分類觀點(diǎn)系統(tǒng)建立了中國海域貽貝分類系統(tǒng)(見表1), 此后我國分類學(xué)者多沿用王禎瑞 (1997)的分類系統(tǒng)(徐鳳山等, 2008; 楊文等, 2013)。

表1 王禎瑞(1997)采用的分類系統(tǒng)

Tab.1 Classification system used in Wang (1997)

隨著分子系統(tǒng)學(xué)研究的不斷深入, DNA條形碼技術(shù)(Hebert, 2003)、分子系統(tǒng)發(fā)育分析被用于解決貽貝分類問題, 如Owada(2007)通過分子數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)為并系群,和形態(tài)相似是由于趨同進(jìn)化導(dǎo)致。Lee等(2004)通過比較DNA序列發(fā)現(xiàn)弗羅里達(dá)群體存在4種隱存種。我國近年來仍舊沿用依據(jù)形態(tài)分類構(gòu)建的貽貝分類系統(tǒng), 亟需輔助分子手段重建貽貝科演化關(guān)系。28S rDNA是核糖體編碼基因中最長的序列, 包含12個變異率較高的序列(D1-D12),其中D2、D3區(qū)不僅變異率高且保守度高, 故而常作為物種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化的研究依據(jù)(Dietrich, 2001)。本研究將著眼于貽貝科這一重要海洋經(jīng)濟(jì)類群, 利用28S rDNA基因序列片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 探討中國常見貽貝物種之間的親緣關(guān)系, 這一工作將對完善我國海洋貝類分類體系有重要意義, 為中國的海洋生物多樣性開發(fā)與保護(hù)提供重要資料。

1 材料與方法

1.1 樣本信息采集

本研究所用樣品涉及貽貝科6亞科12屬28種, 其中10種為本次研究測序, 18種來自GenBank。測序樣品采集于2011—2018年, 95%酒精固定保存并拍照記錄其殼形(見圖1)。外群的合理選擇直接影響系統(tǒng)發(fā)生分析的可靠性, 本研究選取與貽貝目貽貝科物種親緣關(guān)系較近的簾蛤目(Veneroida)的沙篩貝(作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群, 在GenBank檢索貽貝科常見物種以及外群沙篩貝共計31條28S rDNA基因片段序列, 各物種所屬科屬和登錄號等信息見表2。

圖1 本實(shí)驗(yàn)測序樣本照片

表2 貽貝科物種及外群28S rDNA基因序列號

Tab.2 28S rDNA gene ID for Mytilidae and outgroupspecies

注:*表示本次研究測序的樣本

1.2 DNA提取及目的基因PCR擴(kuò)增

從貽貝樣品中取出閉殼肌處肌肉20—30μg, 參照TIANamp Marine Animals DNA Kit試劑盒(離心柱型)操作說明提取DNA。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerase chain reac-tion(PCR)獲得28S rDNA基因片段。實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增使用引物序列為: 28SF: 5′-GGGACTA CCCCCTGAATTTAAGCAT-3′, 28SR: 5′-CCAGCTA TCCTGAGGGAAACTTCG-3′。25μL的PCR反應(yīng)體系, 其中引物0.2μmol/L, 50—70ng DNA模板, 2×PCR Taq mix12.5μL, ddH2O加至25μL。PCR儀循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下: 94°C預(yù)變性5min, 30個擴(kuò)增循環(huán)(94°C變性45s, 56°C退火1min, 72°C延伸1min), 72°C延伸10min, 4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測序。使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi.)對所得序列進(jìn)行同源性檢索, 以檢驗(yàn)物種鑒別的正確性, 為系統(tǒng)發(fā)育分析做準(zhǔn)備。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析與遺傳距離

本次研究獲得的28S rDNA片段使用Clustal W(Thompson, 1994)進(jìn)行多序列比對, 并進(jìn)行人工校對, 刪除結(jié)果中的空位及其他對比模糊區(qū)域, 調(diào)整部分空位位置。使用MEGA X(Kumar, 2018)分析序列的堿基組成, 計算物種兩兩之間的Kimura 2-parameter遺傳距離。

本研究選用最大似然法(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯推論法(Bayesian inference, BI)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建使用PhyloSuite v1.1.16 (Zhang, 2020)軟件, 操作步驟如下: 選擇MAFFT (Katoh, 2013)自動模式進(jìn)行序列常規(guī)對比; 應(yīng)用ModelFinder (Kalyaanamoorthy, 2017)對28S rDNA部分序列篩選模型, 得到基于貝葉斯信息準(zhǔn)則(Bayesian Information Criterion, BIC)選擇核苷酸最佳替換模型, 并估計相關(guān)參數(shù); 以沙篩貝為外群, 使用MrBayes 3.2.6 (Ronquist, 2012)構(gòu)建貝葉斯樹時, 采用ModelFinder推薦的最佳替換模型GTR+F+I+G4, 同時構(gòu)建4條馬爾代夫鏈, 以隨機(jī)數(shù)為起始樹, 共運(yùn)行1000萬代, 每10000代抽樣一次, 初始25%的采樣數(shù)據(jù)作為老化數(shù)據(jù)丟棄, 根據(jù)剩余樣本構(gòu)建一致樹; ML樹的構(gòu)建使用軟件IQ-TREE (Nguyen, 2015)自動選擇模式, 對5000個超快樣本進(jìn)行引導(dǎo), 并使用SH-aLRT branch test (Guindon, 2010), 經(jīng)1000次自展法(bootstrap)確定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的置信度。最終得到的系統(tǒng)發(fā)育樹使用軟件Figtree v 1.4.3(http://tree.bio.ed.ac. uk/software/figtree/)查看和編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列組成及遺傳距離分析結(jié)果

本研究共獲得貽貝科40個個體的28S rDNA序列, 與作為外群的沙篩貝共同進(jìn)行序列比對后, 去除引物段堿基并刪除缺失位點(diǎn)后, 對773bp共有序列進(jìn)行分析顯示, 保守位點(diǎn)447個, 約占57.83%; 變異位點(diǎn)326個, 簡約信息位點(diǎn)233個, 自裔位點(diǎn)93個。T、C、A、G堿基平均含量為20.02%、27.24%、20.39%、32.35%。其中, A+T含量(40.41%)小于G+C含量(59.59%), 表現(xiàn)出一定的堿基組成偏倚。

通過計算物種28S rDNA基因片段序列兩兩之間遺傳距離, 獲得種內(nèi)、屬內(nèi)、屬間物種遺傳距離分布箱線圖(圖2)。研究發(fā)現(xiàn): 本研究貽貝科種內(nèi)遺傳距離的平均值為0.01; 同屬物種間的平均遺傳距離值為0.034, 其中80%小于0.08, 但刻緣短齒蛤與短齒蛤?qū)倨渌锓N的遺傳距離均大于0.1, 顯著大于屬內(nèi)種間平均遺傳距離0.034; 不同屬物種間的遺傳距離平均值為0.115, 91%在0.08—0.20之間; 以上數(shù)據(jù)說明遺傳距離隨著分類階元的不斷提高而增大。由圖可知, 一般情況下, 同屬物種的遺傳距離差異較小, 只有短齒蛤?qū)俚膶賰?nèi)種間遺傳距離波動范圍較大; 此外, 原隔貽貝屬(王禎瑞, 1997)在國際上已經(jīng)劃分為屬和屬, 原石蟶屬(王禎瑞, 1997)已經(jīng)劃分為屬和屬, 本研究中,屬和屬之間的平均遺傳距離顯著大于0.1, 明顯位于屬間物種平均遺傳距離范圍中, 本研究結(jié)果支持國際最新劃分標(biāo)準(zhǔn)?？傮w來看, 貽貝種間、屬間28S rDNA基因遺傳距離差異顯著, DNA間隙明顯, 因此, 28S rDNA基因可用于貽貝系統(tǒng)分類。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

基于28S rDNA重建貝葉斯樹和最大似然樹(見圖3)。從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上來看, 貝葉斯樹與最大似然樹的結(jié)構(gòu)保持一致, 部分分支的結(jié)構(gòu)與支持率有所差異。兩種方法獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹均發(fā)現(xiàn)貽貝科為單系發(fā)生。本研究涉及了貽貝科的6個亞科, 其中深海貽貝亞科Bathymodiolinae和隔貽貝亞科Septiferinae分別為單系群; 貽貝亞科Mytilinae、偏頂蛤亞科Modiolinae、石蟶亞科Lithophaginae的單系性不被支持; 由于細(xì)齒蛤亞科Crenellinae僅有一個物種參與建樹, 其單系性無法驗(yàn)證。貽貝亞科為多系群, 本亞科中的貽貝屬、股貽貝屬、短齒蛤?qū)傥淳奂谝黄?。石蟶亞科的膜石蟶屬的短石蟶和銼石蟶單獨(dú)聚集在一個分支(PP=1, BP=100), 并未與石蟶屬的光石蟶和聚集在同一枝系。其中石蟶屬與偏頂蛤亞科的短殼腸蛤聚集在同一分支, 但貝葉斯后驗(yàn)概率不高; 膜石蟶屬則與深海偏頂蛤亞科物種以及偏頂蛤亞科的屬物種聚集在一起。偏頂蛤亞科Modiolinae中屬、屬和偏頂蛤?qū)僖参淳蹫橐恢? 為多系群。

圖2 基于貽貝科6亞科28S rDNA基因片段序列構(gòu)建的兩兩物種間遺傳距離箱線圖

注:‘*’為極值; ‘o’為離群值; ‘-’為平均值; 橫軸字母表示屬名; 其中-為刻緣短齒蛤與短齒蛤?qū)倨渌锓N間的遺傳距離;-表示刻緣短齒蛤與貽貝屬其他物種之間的遺傳距離;-、-、-、-、-均表示兩兩屬間的遺傳距離

從屬單系性來看, 本次研究中, 有8個屬在系統(tǒng)發(fā)育樹中表現(xiàn)為單系群并獲得較高支持率, 即:屬(PP=1, BP=100)、膜石蟶屬(PP=1, BP=100)、屬(PP=1, BP=100)、石蟶屬(PP=1, BP=99)、屬(PP=1, BP=97)、屬(PP=1, BP=83)、屬(PP=1, BP=92)和屬(PP=1, BP=100); 短齒蛤?qū)俚膯蜗敌圆槐恢С? 其中，刻緣短齒蛤并未與短齒蛤?qū)倨渌锓N聚集在一處, 而是與貽貝屬的物種聚集在同一分支且節(jié)點(diǎn)支持率較高(PP=1, BP=99); 另外屬、屬和屬在本次研究中只有一個物種參與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 目前無法判斷其單系性。

3 討論

3.1 不同建樹方法的比較

ML法和BI法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本結(jié)構(gòu)相同; ML樹與BI樹之間的差異主要表現(xiàn)在: 隔貽貝屬與屬是否為姊妹群, 共同構(gòu)成隔貽貝亞科;屬和屬是否為姊妹群;屬與深海偏頂蛤?qū)偈欠駷殒⒚萌? 此外, 最大似然樹的部分節(jié)點(diǎn)置信度優(yōu)于貝葉斯樹的節(jié)點(diǎn)后驗(yàn)概率, 但貝葉斯樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于最大似然樹; 對于屬階元分支的節(jié)點(diǎn)支持率, 兩種樹基本保持一致。總的來說, 支持率較低或不一致的節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)在大枝系節(jié)點(diǎn), 多為屬間或亞科之間關(guān)系的節(jié)點(diǎn), 同樣的問題也出現(xiàn)在線粒體基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(劉君等, 2011; Liu, 2018), 這種現(xiàn)象可能是由于貽貝早期輻射進(jìn)化造成的。通過增加物種數(shù)目和多基因聯(lián)合分析, 提供物種之間完整的演化信息, 會改善深部節(jié)點(diǎn)的支持率 (Liu, 2018)。

圖3 貽貝科28物種基于28S rDNA序列構(gòu)建的貝葉斯樹(BI樹)和最大似然樹(ML樹)

注:枝上數(shù)字代表ML樹的自展值bootstraps(BP)和貝葉斯樹的后驗(yàn)概率(PP), 顏色相同的分支表示同一屬; “*”表示本次實(shí)驗(yàn)測序物種, “-”表示節(jié)點(diǎn)支持率小于50%; 進(jìn)化樹右側(cè)為各屬對應(yīng)亞科名

3.2 我國貽貝系統(tǒng)分類存在的問題

從系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果來看, 貽貝在亞科階元的分類存在諸多問題, 需要獲得充足的物種樣本以進(jìn)行亞科階元的研究。

在我國目前的貽貝分類系統(tǒng)中, 條紋隔貽貝屬名依然采用屬名。但在國際上Trovant等 (2015)和Gerdol等 (2017) 已經(jīng)根據(jù)分子數(shù)據(jù)將條紋隔貽貝和劃入屬, 并更名為Wiegmann, 1837和Conrad, 1837, 這一劃分方法與本研究所得結(jié)論一致: 通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹我們發(fā)現(xiàn)屬和屬均為單系群, 且分支節(jié)點(diǎn)支持率較高; 此外, 通過貽貝科物種兩兩之間的遺傳距離圖可知,屬物種與屬隆起隔貽貝和隔貽貝之間的平均遺傳距離為0.114, 大于屬內(nèi)種間平均遺傳距離。本研究所得系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與屬內(nèi)種間遺傳距離均支持屬的有效性。此外, 從系統(tǒng)發(fā)育樹我們發(fā)現(xiàn)屬與隔貽貝屬的物種聚集在同一分支且表現(xiàn)為姊妹群, 親緣關(guān)系較近, 目前隔貽貝亞科Septiferinae的有效性得到支持

其次, 在我國目前的分類系統(tǒng)中, 膜石蟶屬為石蟶屬的亞屬。但國際上Owada(2007)根據(jù)分子系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果將提升到屬的地位, 并將兩屬歸為同一亞科(Carter, 2011; Morton, 2015)。本研究中, 根據(jù)遺傳距離(圖2)可知,屬和屬之間的平均遺傳距離為0.07, 小于屬間平均遺傳距離(0.115), 親緣關(guān)系較近; 由系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可知,屬與屬分別為單系群但兩屬物種并未聚為一支, 石蟶亞科的單系性未獲得系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的支持, 這與Owada(2007)研究結(jié)果一致。此外, 石蟶屬與腸蛤?qū)僭谙到y(tǒng)發(fā)育樹上聚集在同一分支, 遺傳距離圖顯示石蟶屬與腸蛤?qū)僦g的平均遺傳距離為0.094, 小于屬間平均遺傳距離; 而膜石蟶屬則與偏頂蛤亞科物種親緣關(guān)系較近, 但支持率均不高, 因此石蟶亞科的有效性需要獲得更全面的物種以進(jìn)一步驗(yàn)證。

在本次研究中, 刻緣短齒蛤并未與短齒蛤?qū)倨渌锓N聚集在一起, 而是與貽貝屬的物種聚集在同一分支, 支持率較高; 通過遺傳距離圖可知, 刻緣短齒蛤與短齒蛤?qū)倨渌锓N之間的平均遺傳距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于屬內(nèi)種間平均遺傳距離, 而它與貽貝屬物種之間的平均遺傳距離為0.087, 同樣大于屬內(nèi)平均遺傳距離(0.034), 故也不應(yīng)歸為貽貝屬。刻緣短齒蛤Dunker, 1857最初被命名為Dunker, 1857, 因此我們建議恢復(fù)刻緣短齒蛤?qū)倜鸇unker, 1857。

4 結(jié)論

本次研究涉及貽貝科6亞科12屬28種, 獲得的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系在亞科階元的節(jié)點(diǎn)支持率較低, 提示我們需要進(jìn)一步獲得更多樣品進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建。本次研究中只有深海貽貝亞科Bathymodiolinae和隔貽貝亞科Septiferinae為單系群, 貽貝亞科Mytilinae和偏頂蛤亞科Modiolinae, 以及石蟶亞科Lithophaginae的單系性不被支持。在屬階元, 深海偏頂蛤?qū)?、貽貝屬和股貽貝屬為單系群。隔貽貝屬(王禎瑞, 1997)的條紋隔貽貝和與隔貽貝屬其余物種遺傳距離較大, 建議接受將屬從原隔貽貝屬劃分出來。原石蟶屬中的膜石蟶亞屬在系統(tǒng)發(fā)育樹中并未與石蟶屬其余物種聚集, 建議將膜石蟶亞屬提升至屬的地位。此外, 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離結(jié)果表明, 刻緣短齒蛤與短齒蛤?qū)倨渌锓N親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 因此建議恢復(fù)刻緣短齒蛤?qū)倜鸇unker, 1857。對于我國常見貽貝的初步分析顯示, 我國貽貝的種類組成需要進(jìn)一步明確, 分類系統(tǒng)亟需重新修訂, 以便為貽貝物種資源的開發(fā)利用與保護(hù)提供支持。

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Phylogenetic analysis based on partial 28S rDNA sequence of familyin China

GUO Jia1, 3, XIE Hui-Ying3, ZHANG Zhen1, 4, HU Li-Sha1, 2, 4, LIU Yu-Meng1, 2, 4, MA Pei-Zhen1, 4, WANG Hai-Yan1, 4, LI Cui1, 4

(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China; 3. Ocean University of China, Qingdao, 266100; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

There are about 400 species of marine mussel (Mollusca: Bivalvia: Pteriomorphia: Mytilida: Mytiloidea: Mytilidae) living all over the world, and they adapt to the highly variable habitats in both intertidal zone and deep sea. In this study, 28S rDNA gene of species in this family along Chinese coasts were collected and phylogenetic trees were reconstructed by maximum likelihood and Bayesian inference methods. The results showed that subfamilies Mytilinae, Modiolinae, and Lithophaginae were not monophyletic groups. At genus level,,andare monophyletic groups. The result supports the new classification scheme for genusthat should be divided intoandand the elevation of subgenus(belonging to genus) to genus level. However, the monophyly of genusis not supported. Thehas larger genetic distance from other species in the genus and they did not form a single clade in phylogenetic trees. Therefore, it is suggestedbelongs to a different genus and weshould still use its original genus name,(Dunker, 1857).

Mytilidae; 28S rRNA; molecular phylogeny

* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 41776179號, 41906083號; 中國海域貽貝超科系統(tǒng)分類與關(guān)鍵性狀演化研究; 十三五“藍(lán)色糧倉科技創(chuàng)新”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目, 2019YFD0901303號; 中國科學(xué)院戰(zhàn)略生物資源能力建設(shè)項(xiàng)目, KFJ-BRP-017-40號。郭 笳, E-mail: gj9683@stu.ouc.edu.cn

王海艷, 研究員, E-mail: haiyanang@qdio.ac.cn; 李 翠, 博士, E-mail: licui19877322@163.com

2020-02-10,

2020-03-18

P745; Q19

10.11693/hyhz20200200038