晏昆 蒙凌 陳玉芳

動脈粥樣硬化性腦梗死是一種常見且頻繁發(fā)生的疾病,嚴(yán)重威脅著人類健康。調(diào)查研究顯示［1］,大多數(shù)動脈粥樣硬化性腦梗死的病理基礎(chǔ)都是由于動脈粥樣硬化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPARγ 基因與很多慢性疾病有關(guān),例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏病、糖尿病等。PPARγ 基因在動脈粥樣硬化形成的病理過程起著很大的影響?，F(xiàn)在,除了高血壓和糖尿病等動脈粥樣硬化性腦梗死的原因,遺傳因素也成為了一個危險(xiǎn)因素。所以,本研究的主要是研究基因和分子水平上的PPARγ 基因與動脈粥樣硬化性腦梗死之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣州新海醫(yī)院2017 年10 月～2018 年12 月收治的100 例經(jīng)CT/MRI 檢查有低密度梗死區(qū)且血脂生化指標(biāo)顯示有異常的患者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,100 例體檢或因周圍神經(jīng)病變等入院行頭顱MRI 未發(fā)現(xiàn)腦梗死病變的患者設(shè)為對照組。實(shí)驗(yàn)組高血壓55 例,22 例糖尿??；對照組高血壓22 例,糖尿病8 例。所有研究對象均簽署了知情同意書。兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較(,n)

表1 兩組一般資料比較(,n)

注：兩組比較,P＞0.05

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①缺血性中風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國腦血管疾病學(xué)術(shù)會議確診的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②中風(fēng)后24～48 h 內(nèi)到本院神經(jīng)內(nèi)科就診；③在第1 次或第2 次中風(fēng)之前沒有腦血管狹窄的病史；④病變血管中有［2］：a.顱前循環(huán)血管。大腦中動脈M1 段和頸內(nèi)動脈、前腦動脈A1 段、前交通動脈等；b.后顱循環(huán)血管。例如：后交通動脈和腦后動脈P1 節(jié)段、椎基底動脈。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①在2 周內(nèi)服用過葉酸或B 族維生素；②肝腎功能嚴(yán)重衰竭；③近一段時(shí)間使用過免疫抑制劑,例如甲氨蝶呤、雌激素、節(jié)育藥、抗凝劑、炎性抑制劑、抗癲癇藥(如苯妥英鈉、卡馬西平)；④非動脈粥樣硬化性血管狹窄。

1.3 方法 選擇兩個SNP 位點(diǎn)rs1875796(Hha I 位點(diǎn),SNP1)和rs1699337(Hinf I 位點(diǎn),SNP2),以通過限制性酶片段多態(tài)性去檢測SNP 的基因型。①提取基因組DNA 通過DNA 提取試劑盒(Promega)的方法。②PCR反應(yīng)：使用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。SNP1 位點(diǎn)上游引物：5'-GTGGCTATCTTTGCTG-TTTG-3'；下游引物：5'-ACCAAGTGTCRRCCTCCTG-3'；SNP2 上游引 物：5'-TRCTFGACCACCGAGCT-3'；下游引物：5'-CTCTGCGTAGCTGATTGGA-C-3'。PCR 反應(yīng)體系為25 μl,包括25 μl 雙蒸餾水,10 mmol Tris-HC1(pH 8.3),50 mmol KC1,1.5 mmol MgC12,4 種dNTP 各200μmol,引物各0.4 μmol,TaqDNA 聚合酶(Promega)1.0 U,基因組DNA 30～50 ng。PCR 反應(yīng)條件：在94℃預(yù)變性5 min,在94℃變性45 s,在55℃變性1 min,在72℃延展1 min 35 個循環(huán),在72℃延伸10 min。③酶消化系統(tǒng)：PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切核酸酶(Promega)消化。在37℃水浴中4～6 h,在凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)下用2%瓊脂糖凝膠電泳(90 mV)30～40 min 后觀察結(jié)果［3］。

1.4 觀察指標(biāo) 檢查兩組生化指標(biāo)(TG、CHOL、LDL-C、HDL-C),分析基因多態(tài)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。多組比較采用編秩后單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni 校正法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生化指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)組TG、CHOL、LDL-C均高于對照組,HDL-C 低于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組生化指標(biāo)比較(,mmol/L)

表2 兩組生化指標(biāo)比較(,mmol/L)

注：與對照組比較,aP＜0.05

2.2 基因多態(tài)性

2.2.1 PPARγC161T 本實(shí)驗(yàn)PCR 擴(kuò)增的目的基因片斷長度為200 bp。當(dāng)堿基C 突變?yōu)門 后,不能被限制性內(nèi)切酶EcoR72I 識別,故TT 純合型因酶切位點(diǎn)消失,酶切電泳后僅見200 bp 1 條帶；CC 型為野生純合型,是常見基因型,可被酶切為120 bp、80 bp 2 條帶；CT為突變雜合型,酶切后可見200 bp、120 bp、80 bp 3 條帶。

2.2.2 PPARβ+294T/C 本實(shí)驗(yàn)PCR 擴(kuò)增的目的基因片段長度為269 bp。當(dāng)堿基T 突變?yōu)镃 后,可被限制性核酸內(nèi)切酶BSLI 識別并酶切,故可見突變純合子CC 型被切為167 bp 和102 bp 2 個電泳條帶；而TT野生純合型無酶切位點(diǎn),是常見基因型,酶切電泳后僅見269 bp 1 條帶；CT 型為突變雜合型,電泳后產(chǎn)生269 bp、167 bp、102 bp 3 個電泳條帶。

3 討論

動脈粥樣硬化性腦梗死的大多數(shù)基本病變是由于動脈粥樣硬化,在動脈粥樣硬化的形成中PPARγ 基因扮演著重要的角色,所以動脈粥樣硬化性腦梗死的潛在候選基因很有可能就是PPARγ 基因［4］。

PPAR 基因是編碼60kD 的蛋白,位于人類染色體3 號染色體(3p25)的短臂上。目前,關(guān)于腦梗死與PPARγ 基因之間關(guān)系的研究很少。有學(xué)者證實(shí)腦梗死和PPARγ 基因2 號外顯子Prol2Ala 錯義突變沒有明顯的關(guān)系［1］。即使是進(jìn)化上最古老的常見多態(tài)性中最微小的有害突變在人類進(jìn)化中很難遺留下來,而且許多和疾病相關(guān)遺傳標(biāo)記的非編碼區(qū)或基因功能都在未知的區(qū)域。所以選擇位于第5 內(nèi)含子的rs1699337位點(diǎn)和位于第4 內(nèi)含子的rs1875796 位點(diǎn)AS 基因標(biāo)記來研究AS 腦梗死和PPARγ 基因之間的關(guān)系。PPARγ 在脂肪組織以及小腸和脾臟中高表達(dá)。通過對基因轉(zhuǎn)錄的協(xié)同作用,認(rèn)為PPAR 途徑對于脂肪細(xì)胞分化,胰島素樣作用和脂肪代謝都起著很大的重要性。研究調(diào)查顯示,激活PPARγ 具有抗動脈粥樣硬化的抗炎作用,通過對平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的遺址,來起到內(nèi)皮素-Ⅰ和Ⅰ纖溶酶激活劑的表達(dá)作用的遺址,使得血管舒張,血纖蛋白的形成的較少,血栓形成的遺址。PPARγ 基因進(jìn)程的不斷發(fā)展,要就PPARγ基因進(jìn)程的已發(fā)展到了到神經(jīng)系統(tǒng)疾病,但是大多數(shù)研究都在實(shí)驗(yàn)動物和受體激動劑上。再灌注腦缺血后,腦組織會有顯著的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腦缺血后的第二次損傷的發(fā)生［5］PPARγ 激動劑抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生時(shí)通過抑制炎癥信號的方法來抑制炎癥反應(yīng)。相關(guān)的炎癥信號傳導(dǎo)途徑包括激活蛋白-1(AP-1),NF-kB,活化T 細(xì)胞核因子(NFAT),JAK-STAT 等。

綜上所述,在動脈粥樣硬化的形成中PPARγ 基因扮演著重要的角色,動脈粥樣硬化性腦梗死的潛在候選基因很有可能就是PPARγ 基因。